JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Fareler içinde ateroskleroz ölçümü

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59828
, , ,
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine,Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine,University of Southern Denmark (SDU)

Summary

Ateroskleroz murine modelleri, moleküler düzeyde patojenik yolları araştırmak için yararlı araçlardır, ancak lezyon gelişimi için standartlaştırılmış bir ölçmek gerektirir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachioksefalik arter dahil olmak üzere ana arter damarlarında lezyon boyutunu belirlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Kardiyovasküler hastalık dünyada ölümün ana nedenidir. Çoğu durumda temel neden ateroskleroz, kısmen kronik inflamatuar bir hastalıktır. Deneysel ateroskleroz çalışmaları, hastalık sürecinde kolesterol ve inflamasyonun rolünü aydınlatılamamıştır. Bu, aterosklerozun klinik bulgularının azalmasına neden olan ilaç ajanları ile başarılı klinik deneyler yaptı. Hastalığın fare modellerinde dikkatli ve iyi kontrollü deneyler, tam olarak anlaşılmayan hastalığın patogenezini daha da aydınlatabilir. Standartlaştırılmış lezyon Analizi deneysel varyasyon azaltmak ve yeniden üretilebilirliği artırmak için önemlidir. Aort kökü, aort kemerinde ve brachioksefalik arter lezyonunun büyüklüğü, deneysel aterosklerozda ortak uç noktalarıdır. Bu protokol, tek bir fareyle tüm bu sitelerde ateroskleroz değerlendirilmesi için teknik bir açıklama sağlar. İletişim kuralı özellikle, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların karakterize edildiği durumlarda sıklıkla olduğu gibi malzeme sınırlı olduğunda yararlıdır.

Introduction

Kardiyovasküler hastalık her dört ölüm1biri için iskemik kalp hastalığı ve inme muhasebe ile dünyada ölüm ana nedenidir. Çoğu olguda ateroskleroz, büyük ve orta ölçekli arterlerde kronik inflamasyon belirtileri ile lipid yüklü plaklar yavaş birikme ile karakterize bir hastalık neden olur2. Hastalık genellikle birkaç on yıl içinde fark edilmeden bir yırtılması veya plak erozyonu iskemik doku hasarına yol açan bir arteriyel tromboz verir kadar kalır.

Normal bir arter endotel hücreleri ile intima tabakadan oluşur ve seyrek dağıtılmış pürüzsüz Kas hücreleri, pürüzsüz Kas hücreleri ve elastik Lamellae ile bir medya katmanı, ve gevşek bağ dokusu ile çevreleyen adventisyal tabaka3. LDL ofset ateroskleroz gelişimi intimal tutma4. Lipoproteinlerin birikmesi ve değiştirilmesi, arteriyel intima5içinde toplama ve tuzağa yol açar. Sıkışan ve değiştirilmiş lipoproteinler6‘ da enflamatuar bir tepki uyarıldı. Endotel hücreler yapışma molekülleri ifade etmeye başlar, VCAM-1 gibi türbüstart kan akımı ile arter ağacında sitelerinde, dolaşan monositler ve diğer lökositlerin işe önde gelen7. İnfiltrasyon monositler makrofajlar arasında farklılaştırarak lipid içeren makrofaj köpük hücrelerine dönüşen dönüşüm8.

Ateroskleroz, 1980 ‘ lerin ortalarında beri frekans artan fare modellerinde incelenmiştir. C57BL/6 Bu çalışmalar için en sık kullanılan doğuştan fare gerinim, ve genetiği değiştirilmiş suşların çoğunluğu için genetik arka plan olarak kullanılır9. Bu gerinim 1920 ‘ li10‘ da kuruldu ve genomu112002 yılında yayınlandı. Fare modellerinde deneyler çeşitli faydalar vardır: koloniler hızlı yeniden, konut alan verimli ve üreme deneysel değişkenlik azaltır. Model aynı zamanda hedeflenen gen silmeleri ve transgenler ekleme gibi genetik manipülasyon sağlar. Bu, hastalığın yeni patofizyolojik anlayışına ve yeni tedavi hedeflerini12‘ ye götürdü.

Vahşi tip C57BL/6 fareler doğal olarak ateroskleroza dayanıklıdır. Onlar HDL içinde dolaşım kolesterol çoğu var, ve karmaşık aterosklerotik lezyonlar bile yüksek yağ ve yüksek kolesterol diyet beslenen oluşturulmaz13. C57BL/6-arka planda ApoE-/- gibi hiperkolesterolemik fareler, bu nedenle ateroskleroz14,15deneysel modeller olarak kullanılır. ApoE eksikliği, kalıntı lipoproteinleri ve ciddi perturbs lipid metabolizması hepatik alımı zarar. ApoE-/- fareler, dolaşım kolesterol ağırlıklı olarak VLDL partikülleri, ve fareler düzenli bir Chow diyet karmaşık aterosklerotik plaklar geliştirmek.

Ldlr-/- fareler ailesel hiperkolesterolemi16olan insanlarda görülen ateroskleroz gelişimini taklit. Ldlr-/- fareler ateroskleroz geliştirmek için Batı tipi diyet gerekir17. Batı diyet insan gıda alımı taklit ve genellikle% 0,15 kolesterol içerir. LDL reseptörü ApoB100 ve ApoE ‘yu tanır ve endossitoz yoluyla LDL parçacıklarının alımı için aracılık eder. LDL reseptörleri, hematopoetik hücrelerde LDL reseptör ifadesi bu süreci etkilemez iken, LDL karaciğer Temizleme için temeldir. Bu, ldlr+/+ hücrelerinin kemik iliği nakli olasılığını hiperkolesterolemik ldlr-/- alıcılar ve ateroskleroz gelişiminin değerlendirilmesi için açar. Kemik iliği Chimeras yaygın deneysel ateroskleroz hematopoetik hücrelerin katılımı incelemek için kullanılmıştır. Ancak kemik iliği nakli, aterosklerotik plakların boyutunu ve bileşimini etkileyebilir, sonuçların yorumlanmasını belirsiz hale gelebilir.

Ek genetik değişikliklerle ApoE-/- ve ldlr-/- fareler farklı türevleri hastalığın belirli süreçleri incelemek için geliştirilmiştir18. Bir örnek, insan APOB100-transjenik ldlr-/- (Hubl) fareler olan tam uzunlukta insan APOB100 geni taşır19,20. Bu fareler düzenli bir Chow diyet hiperkolesterolemi ve ateroskleroz gelişir. Ancak, kompleks aterosklerotik plakların geliştirilmesi en az altı ay sürer ve daha kısa deneysel protokoller genellikle Batı diyeti21‘ i kullanır. Plazma kolesterolün büyük bir kısmı LDL partikülleri içinde dolaşıyor, bu da Hubl farelerine ApoE-/- ve ldlr-/- Mice ile karşılaştırıldığında daha insan benzeri dislipidemik lipoprotein profili verir. Hubl fareler de ınsan ApoB bir otoantijen olarak çalışmalara izin22.

Ateroskleroz fare modelleri insan hastalığının ortak özellikleri ile karmaşık aterosklerotik plaklar geliştirir. Ancak plaklar, ortaya çıkan miyokard infarktüsü ile rüptüre oldukça dayanıklıdır. Atherothrombosis sadece spor algılanan ve deneysel değerlendirmek için zorlu23,24,25. Özel plak rüptür modelleri geliştirilmiştir, ancak deneysel alan, plak stabilize edici ajanların değerlendirilmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir modelden yoksun.

Literatürde birçok şekilde aterosklerozun ölçülmesini bildirilmiştir. Son çalışmalar deneysel tasarım, yürütme ve hayvan çalışmaları26raporlama standartlaştırmak etmeye çalıştı. Müfettişlerin laboratuvarlarına uyarlanmış farklı tercihleri ve teknikleri vardır. Çoğu araştırma projeleri de bazı protokol değişiklikleri gerektiren bir şekilde benzersizdir. Hastalığın multiffakyel doğası nedeniyle, optimum kontroller projeler arasında farklılık gösterir. Yerel koşullar ve standardizasyon eksikliği, araştırma alanının gelişmeleri engelleyen hastalık gelişiminde gözlenen farklılıklara neden olabilir. Deneysel değişkenlik farklılıkları da istatistiksel güç hesaplamalarının yerel koşullar altında pilot çalışmalara dayalı olması gerektiği anlamına gelir.

Damar ağacında çeşitli yerlerde aterosklerozun ölçülmesini tavsiye edilir. Bu protokol, tek bir fareyle aort kökü, aort kemeri ve brachioksefalik arter sonuçlarının nasıl elde edileceği açıklanmaktadır, diğer analizler için torakoabdominal aort geri kalanı bırakarak ek olarak. En yüz preparatları, aort kemerinin içinde lipid yüklü plakların hızlı ölçülmesine olanak sağlar. Numuneler dikkatle görüntüleniyorsa, brachioksefalik arter hastalığı yükü de nicelik olabilir. Daha fazla zaman alıcı çapraz kesitleme aort kökü plak kompozisyon ayrıntılı değerlendirme için kullanılabilir birkaç bölüm bırakır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri etik yetkililer tarafından onaylanması gerekir. 1. fare fedakarlığı ve aort Mikrodiseksiyonu Co2 boğulma ve rekor ağırlığı tarafından fare fedakarlık. Numune kürk kontaminasyonu önlemek için 70% etanol ile fare sprey. Fareyi bir fitil konumuna getirin. Juguler çentik, Mayo makas kullanarak orta çizgi kesi yapmak neredeyse aşağı kasık kemiğine kadar uzanan.Dikkat: Yüksek yüzde etanol son derece yanıcı ve ciddi göz tahrişi neden olabilir. Önlem al. Toraks duvarından kalp delinmesi ile fareyi kanını için 23 G iğne kullanın. Bu prosedür genellikle 20 haftalık bir fareden kan 750 μL verir. Tipik olarak, bir Tri-potasyum EDTA kaplı tüp ve diğer yarısında bir serum veya lityum heparin-kaplamalı tüp hacminin yarısını toplamak. Tüpler hafifçe çevirin ve daha fazla işleme kadar oda sıcaklığında tutun. Karın boşluğunu açmak için Orta çizgide parietal peritonumu kesmek için Mayo makas kullanın. Ksifoid işlemi doku forseps ile tutun ve her iki tarafta yanal peritonum açık kesilmiş ve diyafram açmaya devam. Göğüs boşluğunu, kaburga kafesi aracılığıyla mümkün olduğunca yanal olarak keserek açmak için mayo makası kullanın. Daha sonra aort mikrodissecting iken bu enstrümanlar için geniş açıları sağlayacaktır. Perfüzyon sıvı drenajı için sağ auricle bir kesi yapın. Kafatası yönünde kalbin zirvesini üzerinden 27 G iğne takın. En az 2 dakika boyunca 10 mL buz-soğuk fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile fareyi yavaş Mükemmelleştirici iken sol ventrikül içinde sabit iğne tutun. karaciğerde renk değişimi ve paler alma dikkat edin.Not: Bazı protokoller civarında formaldehite perfüzyon kullanır, ancak bu lenfositlerin immünohistokimya analizi gibi birkaç aşağı uygulama ile çakışıyor. Bu nedenle, bu protokolde paraformaldehit ile perfüzyon fikrasyonu yapılmaz. Anatomik forseps ve diseksiyon makası kullanarak ilgi organlarını (örneğin lenf nodları, dalak, karaciğer, bağırsak, inguinal Yağ pedleri, böbrekler, vb.) ayırır. Aort kemeri zarar vermeden kalbin sağ tarafında trakea ve özofagus kes. Viskozitelemi ve retroperitoneumu bağlayan yapıları keserek kalp, aort ve böbrekler içinde situ bırakarak. Akciğer ve iç organlar kaudal uzağa katlayın ve para-aort lenf nodları ve abdominal aortun retroperitoneal mikrodiseksiyonu başlamak için bir peçete ile onları kapsayacak. 6x büyütme bir mikroskoptan altında gösterilmesi başlatın. Dumont forseps ile çevreleyen doku kaldırarak ve Vannas makas ile gerginlik altında kesme aort bifurksiyonu incelemek başlar. Abdominal aort diseksiyonu kransal olarak devam edin. Aort karın dalları Cut ve diyaframda aort geçide üzerinden ıort ücretsiz.Not: Mikrodiseksiyon, stereomicroscope aracılığıyla doğru el-göz koordinasyonunu gerektirir, bu da ustalının bazı pratiği alır. Torasik aorta kapsayan yağ dokusunu çıkarın. Dikkatle dalları ile aort kemer serbest timus dorsal gözden. Karotis arterlerin torasik boşlukta mümkün olduğunca Distil olarak diseksiyon devam eder. Özel durumlarda, karotis bifurkasyonu içerecek şekilde boyun diseksiyonu yapılabilir. Aort kesmeden önce deiyonize su, RNase dekontaminasyon çözeltisi, 70% etanol ve PBS ardışık durulama ile enstrümanları temizleyin. Kalp forseps ile tepe tarafından kaldırın. Kalp yakın aort kes ve PBS ile bir tüp tüm kalbi yerleştirin. Kalp, sürekli işleme ve aort kökü cryomounting önce birkaç saat boyunca buzda depolanabilir. Şekil 1agöre aort kemer kes. 4 °C ‘ de gece 1 mL% 4 formaldehit içeren bir tüpün aort kemerinin üzerine koyun. Numune, sabitleme ve analizden önce birkaç yıl boyunca bu şekilde depolanabilir.Dikkat: Formaldehit kansere neden olabilir, Alerjik cilt reaksiyonları, ve yutulması durumunda zararlı. Gerektiğinde kişisel koruyucu ekipman kullanın. Kalan azalan aortu incelemek ve RNA stabilizasyonu çözümüne koyun veya sonraki RNA analizi veya başka bir uygulama için onu dondurun. Diseksiyon süresini en aza indirmek için iş akışını optimize etmek, aşırı RNA bozulması önlemek için çok önemlidir. Kan toplama tüpleri (adım 1,3 toplanan) bir santrifüjte koyun. Oda sıcaklığında 15 dakika için 1.500 x g ‘de ayrı plazma ve serum tüplerini döndürün. Plazma ve serum mikrosantrifüjlere dikkatle aktarın ve-80 °C ‘ de saklayın. Hem EDTA hem de heparinize plazma veya serum toplama olanaklarını birden fazla aşağı uygulama için sunar. Kalbi, ventral tarafı yukarı bakan bir mantar yatağa yerleştirin. Bir iğne ile mantar kalp Fix Apex. Kalp tabanı anatomik forseps ile tutun. Bir neşter kullanarak kalbin apikal 2/3 kesme yönü ile iki auricles arasında bir çizgi olarak sagittal düzlemde 20 ° kaudal ve 20 ° ‘ de (Şekil 1B) mükkülü düzlem içinde, neşter açılı bir hat olarak olmak. Çevreleyen, ancak doku sızmak değil optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşik, aort kökü embed. EKIM bileşik kalp tabanı batırın. Hafifçe EKIM ile aort kökünü doldurmak ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için forseps ile kalbi sıkın. Numune EKIM ile dolu bir cryomold altına aktarın. Aort kökü şimdi alt yüzeye dik olmalıdır. Dondurmak için monte kalp Kuru buz üzerine koyun. Numuneleri, bu protokolde Bölüm 3 ‘ e göre kriyobölümleme takip edene kadar-80 °C ‘ de fermuar kilit poşetlerinde saklayın. Şekil 1: kalp ve aort kemerinin içinde situ. (A) akciğer, trakea, özofagus, ve timus bir mikrograf, ölçek Bar = 2 mm düzenli Chow diyet bir 20 hafta eski kadın ApoE-/- fare içinde situ içinde Aort kemer görüntülemek için kaldırılır. Noktalı çizgiler Aort kemer ve dalları kesmek nerede gösterir. (B) kalp ve aort şematik bir betimsiyon. Kırmızı noktalı çizgi aort kökü cryomounting önce kalp kesme nerede gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 2. en yüz Analizi aort kemeri ve Brachiocephalik arter Aort kemerleri en yüz analizi için yatak sabitleme hazırlayın. Kat Parafin balmumu film sekiz kez bir segment düz 25 mm x 25 mm yüzey yapmak. Aort için karanlık bir arka plan yapmak için siyah elektrik yalıtım bandı ile sarın. Sabitleme yatağın arka tarafına bir etiket yerleştirin ve fare kimlik numarasını yazmak için bir kurşun kalem kullanın (normal kalem mürekkebi boyama işleminde kaybolur). Aort kemer sabitleme yatağa aktarmak ve bunun üzerine PBS bir damla yer. Bir stereomikorkop altında kalan periadventisyel Yağ dokusundan aort temizliği başlar. Vannas makas ve Dumont forseps kullanın, aort manipülasyon veya zarar vermeden tüm çevredeki yağ dokusu uzağa soyma. Sudan IV, yağ dokusu parlak leke olacak ve bu noktada tüm bu doku kaldırmak için çok önemlidir.Not: Gerektiğinde ek PBS uygulayarak her zaman aort nemli tutun. İntimal yüzeyi açığa çıkarmak için aort lümeninde Vannas makas sunarak koronal düzlemde aortu açın. Distal yönde artan kemer dış eğriliği kesmeye başlar ve brakiyosefalik arter dahil dalları açık kesmeye devam. İnen torasik bölgenin dorsal parçasını yedek. Daha az eğrilik açın ve intimal yüzeyi görüntülemek için aort açık kat kes.Not: Bu adım ince motor becerileri gerektirir ve Master bazı uygulama ihtiyacı. Minutien böcek iğneler künt ucunu kullanarak sabitleme yatağa açık kemer pin. Pimlerin yerine koymak için bir mikro Castroviejo iğne tutucu kullanın. Pimleri, yerinde olduğunda örnekten uzağa hafifçe eğin. Numuneyi uzatmadan aort yatağı düz bir şekilde sabitleyin. 4 °C ‘ de PBS ile dolu bir petri tabağı içinde, sabitlenmiş kemeri aşağı dönük olarak saklayın.Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Sudan IV ‘in çalışma çözümünü hazırlayın. Mix 1 g sudan IV toz, 100 mL% 70 etanol, ve 100 mL aseton karanlık bir şişe ve hafifçe karıştırın 10 dakika. Çözümü filtrelemek için gerek yoktur ve oda sıcaklığında karanlık tutulan birkaç ay için kullanılabilir. Eğer boyama rengi tatmin edici değilse, yeni bir çözüm yapılabilir ve numuneler tekrar lekelenebilir.Dikkat: Aseton ciddi göz tahrişine neden olabilecek bir yanıcı sıvıdır. İyi havalandırılmış bir yerde saklayın ve kullanım esnasında önlem alın. Laboratuvar tezgah üzerinde beş Petri yemekleri düzenleyin: bir dolu 70% etanol, biri sudan IV çalışma çözümü ile dolu, iki 80% etanol ile dolu, ve bir PBS ile dolu. Numuneyi 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde durulama ile başlayın ve ilk Petri çanağına sabitleyen yatağı aşağı dönük olarak kemerlerle yerleştiriniz. Numuneyi sudan IV çalışma çözümüne aktarın ve kemeri 7 dakika lekeleyelim. Sonra,% 80 etanol içinde durulayın 3 dakika için iki kez normal intimal yüzey Solusyon için. Sonuçları en iyi duruma getirmek için tahliye süresi ayarlanabilir. Son olarak, numuneyi orijinal Petri tabağına geri koymadan önce PBS ‘de durulayın. Dijital kameraya bağlı 10 kat büyütmede stereomikorkop kullanarak MİKROGRAFİ edinin. PBS ‘de, küçük metal ağırlıkları (20 mm x 10 mm x 5 mm) kullanarak, bir petri çanağının altına sabitleyen yatağı tutmak için, sabitlenmiş kemerin resimlerini çekin. Görüntünün kalibrasyonu için aort yanında bir cetvel yerleştirin. Lezyon alanını ve toplam intimal yüzeyi belirlemek için bir görüntü analiz yazılımı (örn. ımagej) kullanın. Aort kemerinin tanımlanacağı anatomik simgelerden yoksun olarak, genellikle artan aort başından itibaren ilk interkostal dala kadar ölçüm gerçekleştirilir (Şekil 2a). Toplam intimal kemer alanını manuel olarak çevrelenme için yazılımla ilgili alan ölçümleştirme özelliğini kullanın.Not: lezyon ölçümü kör bir şekilde yapılmalıdır ve ikinci bir müfettişin sonuçları onayladığı tavsiye edilir. Imagej ‘de çokgen seçim aracını seçin ve tekrarlanan tıklamalarla toplam kemer alanını çevreleniniz. Ardından, sonuç penceresindeki toplam kemer alanını görüntülemek için Analiz menüsünde ölçümü seçin. Sonra, tüm sudan IV-lekeli plakları Kemer içinde çevreleyen. Sudan IV lipidler, trigliserid ve turuncu-kırmızı renk ile lipoproteinler lekeleri bir lysochrome Diazo boya. Imagej ‘de, FreeHand seçim aracını seçin ve alt tuşuna bastığınızda tüm plakları çevreleniniz. Sonuç penceresinde lezyon içermeyen kemer alanını görüntülemek için Analiz menüsünde ölçüme tıklayın. Toplam kemer alanından lezyon içermeyen alanı çıkararak göreceli lezyon alanını hesaplayın ve ardından sonucu toplam kemer alanına bölerek. Subklavian ve karotis arterlerin, brakosefalik arter lezyonunun ölçülmesini sağlamak için dikkatle sabitleyin (Şekil 2A). Subklavian arter ve ortak karotis arterlerde lezyonların ölçülmesini genellikle çok zorlu ve anlamlı değil, sırasıyla. Imagej ‘de, Shift tuşuna bastığınızda çokgen seçim aracını kullanarak bracioksefalik arter her iki parçasını çevreleyen. Sonuç penceresinde toplam brachiocephalik arter alanını görüntülemek için Analiz menüsünde ölçmek tıklayın. Ardından, FreeHand seçim aracını seçin ve alt tuşuna bastığınızda, brakiyosefalik arter tüm plakları çevreleyen. Sonuç penceresinde lezyon içermeyen brachiocephalik arter alanını görüntülemek için analiz menüsündeki ölçümü tıklayın. Toplam brachioksefalik arter bölgesinden lezyon içermeyen alanı çıkararak göreceli lezyon alanını hesaplayın ve ardından sonucu toplam brachiocephalik arter alanı ile bölünür. Şekil 2: aterosklerotik lezyon ölçümü. (A) bir 20 haftalık erkek insan APOB100-transjenik ldlr-/- (Hubl) Mouse dan aort Arch on hafta boyunca açık ve sudan IV ile lipid açısından zengin plaklar için lekelenmiş tutturulmuş Batı diyeti Fed. Total Aort kemer yüzey alanı mikrograf beyaz noktalı çizgi ile özetlenmiştir, ölçek çubuğu = 2 mm. Sarı noktalı çizgiler, brachiocephalik arter toplam yüzey alanını özetlemektedir. (B) aort kökü Cross-Section 400 μm at aort sinüs bir 20 hafta eski erkek ldlr-/- Mouse Batı diyet Fed sekiz hafta boyunca bir mikrograf içinde görselleştirilen, ölçek Bar = 500 μm. Siyahlı noktalı çizgiler toplam damar alanı ve aterosklerotik lezyonlar arteriyel intima lokalize yağ kırmızı O ile lekelenmiş. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 3. aort kökünün kriyobölümleme Kriyostat sıcaklığını-20 °C ‘ de ve kesit kalınlığına 10 μm olarak ayarlayın. EKIM bloğunu, örnek tutucuda bulunan aort kökünü, ventriküler doku ile dışa dönük olarak bağlayın. Kesmeye başladıktan sonra, kesit yüzeyinin hizalamasını numune tutucusuna paralel olarak ince ayar yapın. Kıvrımsız bölümler toplamak daha kolay hale getirmek için aşırı çevreleyen OCT kaldırın. Aort kökü şimdi kalp tabanı doğru kalıp yerleştirilir verilen bıçak bıçak dik konumlandırılmış olmalıdır. Sıradan mikroskop slaytlar üzerinde ilk kontrol bölümlerini toplayın, hangi atılacaktır. İlk bölümler sadece kalp kas dokusu içermelidir. Şu anda 200 μm tarafından bölünerek ilerleme. Bir bölüm toplayın ve ışık mikroskobu ile ilerlemeyi kontrol edin. Sol ventrikül çıkış yolu yaklaşırken, mikroskop altında her 100 μm kontrol edin. Bir damar duvarının ilk endikasyonları gözlenen zaman, 50 μm için hızını yavaşlatmak.Not: İlk aort Cusp göründüğünde, bu bölümler toplamak için sıfır noktası olacaktır. Bu cusps tam olarak görünür ne zaman görmek zor olabilir, ama tam bir yerelleştirme aynı bölgede lezyonlar karşılaştırmalar gerçekleştirmek için çok önemlidir. Bölüm düzlemini diğer iki cusps ile hizalamak için numuneyi sıfır Cusp noktasına doğru eğin. Bu aort gerçek çapraz bölümler elde etmek için çok önemlidir. Aort kökü bir çizim yapmak, onlar göründüğü gibi cusps gösteren, ve saymak her 10 μm bölüm sıfırdan itibaren kesilir. İkinci bir ekran göründüğünde, numuneyi üçüncü LAMP ile hizalayın. Cusps arasındaki seviye farkı 50 μm ‘ ye geçmemelidir. 90 μm ve sonrası seviyesindeki slaytlarda bölümler toplamaya başlayın. Şekil 3’ teki Slayt planlamasına göre bölümler toplayın. Bölüm koleksiyonu 190 μm den başlatılabilir, aort kökü 50 μm ‘ den fazla ise, kökü düz bir pozisyonda hizalamak için daha fazla alana izin verilir. Seviye 800 μm ‘ ye ulaşana kadar bölümleme işlemine devam edin. Bu seviyede hala görünür plaklar varsa, koleksiyon 1.000 μm ‘ ye genişletilebilir.Not: Basitleştirilmiş bir slayt organizasyonu ek Şekil 1’ de sunulur ve bu da sekleme hızını artırabilir. En iyi slayt planlaması proje planına bağlı olarak karar yapılmalıdır. Koleksiyondan sonra bölümleri düzeltin. Yağ kırmızı O boyama ve 10 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde kollajen Picrosirius kırmızı boyama için toplanan bölümleri düzeltin. Deiyonize suda durulayın, Kuru, ve bu protokolde Bölüm 4 ile takip kadar oda sıcaklığında saklayın. Eğer slaytlar hemen yağlı kırmızı O ile lekelenmeli ve hala ıslanırsa, kurutma sürecini hızlandırmak için 1 dakika boyunca% 60 izopropanol içine yerleştirin.Dikkat: İsopropanol ciddi göz tahriş neden olabilir ve uyuşukluk veya baş dönmesi neden olabilir bir yanıcı sıvıdır. İyi havalandırılmış bir yerde saklayın ve kullanım esnasında önlem alın. İmmünhistokimya veya immünofluoresme için toplanan bölümleri 10 dakika boyunca buzdan soğuk saf aseton için sabitle. oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuru.-20 °C ‘ de mağaza bölümleri. Şekil 3: aort kökünün seri bölümleri için slaytlar organizasyonu. Aort kökünün cryosecting sırasında her 10 μm kalın bölümde ilk 800 μm artan aortun toplanması gerekir. Çeşitli uygulamalar için uygun bölümler elde etmek için sistematik bir slayt organizasyonu gereklidir. Lezyon bileşimi Analizi genellikle lipid için yağ kırmızı O boyama ve kollajen için Picrosirius kırmızı boyama içerir. Kalan bölümler toplanır ve immünhistokimya ve immünofluoresesans boyama için aseton sabit. Bu rakam Gisterå ve Al30’ dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. 4. aort köklerinde yağ kırmızı O boyama ve ateroskleroz ölçümü 100 mL isopropanol içinde 1 gr Oil Red O ‘Yu çözünerek doymuş bir yağ kırmızısı çözümü hazırlayın. Çözümü, oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlık bir şişede karıştırın. Doymuş çözüm birkaç ay boyunca saklanabilir.Not: Bu çözelti ile temas edilmiş ekipman temizlemek zor olduğundan petrol kırmızı O boyama için Laboratuvar donanımları belirlenmiş olması tavsiye edilir. 50 mL deiyonize su ile doymuş yağlı kırmızı O solüsyonun 75 mL ‘yi karıştırarak çalışma çözümünü hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika duralım. nitel filtre kağıdı ile filtre uygulayın. Kaymaları yağ kırmızı O çalışma çözeltisi 20 dakika boyunca yerleştirin. 5 dakika boyunca musluk suyuna durulayın. Doku görselleştirme yardımcı olmak için, 1 dakika için Mayer hematoksilen ile leke. 5 dakika ılık musluk suyuna durulayın. Tüm çekirdekler şimdi mavi renkte lekelenmiş olmalıdır, sonucu optimize etmek için boyama süresini ayarlayın. Sulu bir montaj ortamına (örneğin, Kaiser ‘in gliserol jelatin) slaytlar monte edin. Sıcak Kaiser ‘in gliserol jelatin için 40 ° c kullanmadan önce sıvı yapmak. Montaj ortamı su bazlı olduğundan slaytları kurutmak gerekli değildir. Kapak camı eklerken hava balonu oluşumunu önlemek için dikkatli olun.Dikkat: Kaiser ‘in gliserol jelatin genetik kusurları neden şüphelenilen fenol içerir. Gerektiğinde kişisel koruyucu ekipman kullanın. Işık mikroskobu bağlı bir kamera kullanarak dijital MİKROGRAFİ kazanın. Genellikle tam damar duvarı ve lezyon sınırları açıkça 50 kez büyütme ile görselleştirilebilir. Tercihen etiketli görüntü dosyası formatında (TIFF) yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydedin. Bilgisayar destekli görüntü analizi yazılım sistemi kullanılarak lezyon boyutunun analizini gerçekleştirin. Yağ kırmızısı O, nötr lipidleri lekeler ve lezyon ölçmesine yardımcı olan yoğun bir kırmızı renk ile aterosklerotik plakları görselleştiran bir lysochrome Diazo boyudur.Not: lezyon ölçümü kör bir şekilde yapılmalıdır ve ikinci bir müfettişin elde edilen sonuçları onayladığı tavsiye edilir. Aort damar duvarının dış elastik lamina (Şekil 2B) çevreleyen toplam damar alanını tanımlamak için görüntü analiz yazılımındaki alan ölçümleştirme özelliğini kullanın. Imagej ‘de çokgen seçim aracını seçin ve yinelenen tıklamalarla bölgeyi çevreleniniz. Ardından Analiz menüsünde ölçümü seçin. Toplam gemi alanı sonuç penceresinde görüntülenir. İç elastik lamina ve luminal sınır tarafından tanımlanan geminin intimal tabakasında aterosklerotik lezyonların ölçülmesine devam edin. Genellikle supap üzerindeki lezyonların ölçümü27’ den hariç tutulur. Imagej ‘de, FreeHand seçim aracını seçin ve alt tuşuna bastığınızda tüm plakları çevreleniniz. Sonuç penceresinde lezyon içermeyen damar alanını görüntülemek için Analiz menüsünde ölçümü seçin. Lezyonsuz alanı toplam damar alanından çıkararak ve ardından sonucu toplam gemi alanına bölerek göreli lezyon alanını hesaplayın.Not: Kare mikrometrede mutlak lezyon alanı elde etmek için kullanılan büyütmeye göre görüntü analiz yazılımındaki sonuçları kalibre edin. Toplam lezyon alanının Oil Red O pozitif alanının yüzdesini hesaplamak için görüntü analiz yazılımında renk eşik özelliğini kullanarak lezyonlarda yağlı kırmızı O-lekelenmiş alanı tanımlayın. Imagej ‘de, Shift tuşuna bastığınızda FreeHand seçim aracını kullanarak tüm lezyon alanını çevreleyen. Toplam lezyon alanını görüntülemek için Analiz menüsünde ölçü birimi seçin sonuç penceresinde. Düzen menüsünde dışarıda temizle ‘yi seçin. Görüntü menüsünde resim türünü 8-bit olarak değiştirin. Görüntü menüsünün ayar alt menüsünde Eşik seçeneğini belirleyerek yağ kırmızı O negatif alanı için kırmızı bir eşik ayarlayın. Uygula ‘yı tıklayın. İşlem menüsünün ikili alt menüsünde bu seçeneği seçerek görüntü ikili olun.Not: Genellikle petrol kırmızı O boyama gruplar arasında değişir. Bu nedenle, renk eşik sadece aynı boyama toplu içinde önerilir. Sonuç, eşiğin nasıl belirlendiği ve standartlaştırılmış olduğu bir açıklama ile birlikte sunulmalıdır. Analiz menüsünde parçacıkları analiz seçip Tamam ‘ı tıklatarak resmi analiz edin. Toplam yağ kırmızı O negatif lezyon alanı şimdi Özet penceresinde görüntülenir. Yağ kırmızı O negatif alanı toplam lezyon bölgesinden çıkararak ve sonra toplam lezyon alanına bölünerek göreli yağ kırmızı O pozitif alanı hesaplayın.

Representative Results

Ateroskleroz fare modellerinde en belirgin lezyonlar aort kökü ve aort kemerinin geliştirilmesi eğilimindedir. Bu protokol, aort kökü, aort kemerinde ateroskleroz ve tek bir fareyle brachiocephalik arter miktarını açıklar. Torasik inen aort ve karın aortunda ölçülebilir lezyonlar sadece önceden hastalık olan hayvanlarda bulunur. Bu protokolde, bu parçalar aterosklerotik yük için analiz edilmez, ancak mRNA düzeylerinin veya diğer analizlerin sonraki analizi için kaydedildi. Aort kökündeki aterosklerotik lezyonların seri bölümleri genellikle yekseninde lezyon büyüklüğü ve x-ekseni28′ deki aort sinüs mesafesi ile bir grafikte görüntülenir. Gerçek çapraz bölümler lezyon boyutu ölçümleştirme için çok önemlidir. Eğik bölümler lezyon boyutlarını aşırı tahmin edebilir ve sadece 20 ° ‘ lik bir eğme mutlak lezyon yüzeyini% 1529oranında abartabilir. Bununla birlikte, toplam damar alanının lezyon fraksiyonu hesaplanırken sonuç, seksiyonlama sırasında olası açı farklılıklarına daha az duyarlı hale getirir (Şekil 4A). Gruplar arasındaki farklılıkları algılamak için uygun bir istatistiksel yöntem genellikle normal 2 yönlü bir varyans (ANOVA) analizdir. Bonferroni Post-testler daha sonra belirli düzeylerde farklılıkları algılamak için gerçekleştirilir. Fisher ‘ın en az önemli farkı da ANOVA için bir takip testi olarak kullanılabilir. Bu tür II istatistiksel hataların olasılığını azaltır, ancak birden çok karşılaştırmalar için hesap yok. Buna ek olarak, eğrisi veya fare başına ortalama lezyon boyutu altında alan hesaplamak için açıklayıcı olabilir ve daha fazla gruplar içinde bireysel varyasyon görselleştirmek için bir nokta Plot veri mevcut (Şekil 4b). Yağ kırmızı O nötr lipidler lekeleri yağ çözünür parlak kırmızı Diazo boya olduğunu. Hücre membranlarındaki Polar lipidler lekelenmez. Yağlı kırmızı O boyama, taze, dondurulmuş veya formalin-sabit örneklerinde yapılabilir, ancak gerekli deparafinizasyonda sürecinde lipidlerin çıkarılması nedeniyle parafin-katıştırılmış numuneler üzerinde kullanılamaz. Toplam lezyon alanının yağ kırmızısı O pozitif alanı renk eşik tarafından lezyon lipid birikiminin bir Miktarlama yapılabilir (Şekil 4c). Hematoxylin hücre çekirdekleri mavi bir boyama üretir, hangi plak morfolojisi görselleştirmek için yararlıdır. Sağ ve sol koroner arterlerin genellikle en belirgin lezyon boyutları ile çakıştığı aort sinüs27, yaklaşık 250 μm civarında aortdan sapmak. Bu bölgeden çapraz bölümler genellikle temsili sonuçlar olarak görüntülenir (Şekil 4d). Şekil 4: aort kökündeki aterosklerotik lezyonlar. (A) yirmi sekiz haftalık erkek kemik iliği Chimeras sekiz hafta boyunca Batı diyet beslenen Smad7-eksikliği T hücrelerinin ateroskleroz gelişimi üzerinde etkisini belirlemek için değerlendirildi. Deneysel ldlr-/- Chimeras alınan CD4-CRE+Smad7fl/fl kemik iliği ve kontrol alınan CD4-CRE+Smad7fl/+ kemik iliği. Grafik, toplam damar yüzeyinin lezyon fraksiyonu olarak görüntülenen aort sinüs 100-800 μm, ardışık sekiz bölümden aterosklerotik lezyon alanının miktarını gösterir (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, Cd4-CRE+Smad7fl/fl/ldlr-/- n = 9, 2-yolu ANOVA Bonferroni ‘nin sonrası testi ile, grafik ortalama ± SEM gösterir, parantez gerinim karşılaştırması için önem düzeyini gösterir). (B) kombine nokta arsa ve çubuk grafik aort kök bölümlerinden ortalama aterosklerotik lezyon alanı gösterir (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 6, CD4-CRE+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, öğrencinin t-test) (C) lezyonlarda yağ kırmızı O-lekelenmiş alan kesir (Cd4-CRE+Smad7fl/+/ldlr-/- n = 4, Cd4-CRE+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 6, öğrencinin t-testi, NS = önemli olmayan) (B-C) dots bireysel fareler ve çubukları temsil eder ortalama ± SEM. (D) petrol kırmızı O boyama gösteren temsili MİKROGRAFİ (kırmızı renk) aort kökündeki nötr lipidlerin 300 μm ‘ den aort sinüs (50x büyütme), ölçek çubuğu = 500 μm. *p ≤ 0,05, * * *p ≤ 0,001. Bu rakam Gisterå ve al.31’ den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Yağ kırmızı O en yüz hazırlanmış AAS boyama için kullanılabilir, ancak bu protokol sudan IV, başka bir uygun yağ çözünür Diazo boya kullanır. Sudan IV, lipidler, trigliserid ve lipoproteinleri boyama yoluyla aterosklerotik plakları turuncu-kırmızı renkte açıkça görselleştiriyor. En yüz aort kemerlerinin temsili görüntülerde koyu arka plan çıkarılması görsel ekranı artırabilir (Şekil 5A). Genellikle lezyonlar grup içinde dağıtılır ve gruplar arasında öğrenci t-testi ile istatistiksel testler sağlar. Hem bireysel fareler hem de gruplar arasında karşılaştırıldığında ortalama gösteren bir nokta çizimi, sonuçları görüntülemek için bilgilendirici bir yoldur (Şekil 5B-C). Gruplar içindeki varyasyon genellikle damar ağacında konumlar arasında farklı olduğundan, ayrı güç hesaplamaları genellikle gereklidir. Gereksiz varyasyon yöntemi yeterlilik ve protokol standardizasyon tarafından önlenebilir. İstatistiksel olarak önemli sonuçlar elde etmek önemlidir, ancak gözlenen bir fark için biyolojik alaka her zaman da dikkate alınması gerekir. Şekil 5: aort kemerinde ve brachioksefalik arter aterosklerotik lezyonlar. (A) 20 haftalık fareden sudan IV (turuncu renkte) ile lekelenmiş lipid yüklü plaklar ile aort kemerlerinin yüz mikrografisini temsil eden 10 hafta boyunca Batı diyetini besleyen, birlikte görselleştirildi. Ölçek çubuğu = 2 mm. insan APOB100-transjenik ldlr-/- (Hubl) fareler kontrol olarak kullanılmış ve deneysel grup LDL-reaktif T hücreleri ile TCR-transjenik fareler oluşuyordu (BT1) Hubl fareler için melez. (B) aort kemerinin aterosklerotik lezyonlar (Hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; Öğrenci t-test). (C) brachioksefalik arter aterosklerotik lezyonlar (Hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, öğrencinin t-testi). (B-C) Noktalar bireysel fareler temsil, barlar ortalama ± SEM gösterir. *p ≤ 0,05. Bu rakam Gisterå ve al.32güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Ek Şekil 1: aort kökü seri bölümler için slaytlar alternatif organizasyon. Aort kökünden bölümler toplanması için basitleştirilmiş bir sistematik slayt organizasyonu. Koleksiyon lipidler ve immünhistokimya veya immünofluoresesans boyama için yağlı kırmızı O boyama sağlar. Kollajen Picrosirius kırmızı boyama için adanmış slaytlar atlanıyor. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kardiyovasküler hastalık dünyadaki ana katildir ve yeni önleyici ölçümler gereklidir2. Hastalığın fare modelleri, patofizyoloji ve deneysel tedavilerin incelenmesi için kapsamlı bir platform sağlar13. Bu yaklaşım için güvenilir lezyon boyutu ölçülmesini gereklidir. Ancak, ölçme yöntemleri laboratuvarlar arasında farklılık gösterir. Standardizasyon ve optimizasyon 1980 ‘ den beri devam eden bir süreç olmuştur13,27,33,34. Aort kökleri deneysel ateroskleroz ölçmek için en popüler site olarak ortaya çıkmıştır. Plakların çapraz bölümleri gruplar arasında plak hacminin karşılaştırılması sağlar. En yüz preparatları aort büyük segmentlerinde lezyon ölçümü için tercih edilir. En yüz yöntemi plak miktarını görselleştirir ve plak alanı kapsamının ölçülmesini sağlar, ancak plak kalınlığı dikkate almaz. Gözlenen farklılıklar için biyolojik alaka damar ağacında farklı yerlerde tutarlı sonuçlar tarafından kanıtlanmış. Farklı konumlarda ateroskleroz gelişimini değerlendirmek olası site spesifik etkileri adresleri. Nakledilen hematopoetik hücrelerin ateroskleroz gelişimi üzerine etkisi, hiperkolesterolemik ldlr-/- Chimeras ‘da değerlendirilebilir. Ancak, tüm vücut ışınlama site spesifik etkileri ile ateroskleroz sürecini etkiler. Aort kökünde daha belirgin aterosklerotik lezyonlar gelişirken, aort kemerinde azaltılmış lezyon gelişimi görülür35.

Daha da önemlisi, sadece lezyon büyüklüğü deneysel ateroskleroz çalışmalarında ele alınması gerekir. Lezyon bileşimi de anahtar bir parametredir. Çeşitli plak özellikleri insanlarda hastalığın belirtileri ile ilişkili olmuştur36. Aort kökü seri bölümleme plak kompozisyon dikkatli analizi için kullanılabilir birkaç bölüm bırakır. İnsanlarda Plak rüptürü birkaç pürüzsüz Kas hücreleri, seyrek kollajen içeriği ve plaklar36inflamasyon belirtileri ile ince bir fibröz kap ile karakterize edilir. Plak rüptür ateroskleroz fare modellerinde nadir bir olay olmasına rağmen, plak stabilitesi için belirteçler değerlendirmek için bilgilendirici. Translasyonel yaklaşımlar fare modellerinden mekanik bulguları teyit ve insan hastalığının önemli özelliklerini ortaya çıkarabilir31. Aterosklerotik plakların inflamatuar durumu VCAM-1, MHC sınıf II, makrofajlar ve lenfosit30‘ a ait immünhistokimya boyama ile tespit edilebilir. Bazı protokoller, aterosklerotik lezyon büyüklüğü ve kompozisyon37ölçümü için aort kemerinin koronal düzleminde boyuna bölümler veya brachiocephalik arter kullanır. Ancak, bu alternatif yöntem yalnızca birkaç bölümleri analiz edilecek, hangi sınırlamaları uygulamaları bırakır.

Bu protokolde ilk kritik adım AAS verimli hasat yeteneğidir. Mikroskop altında el-göz koordinasyonu uygulama gerektirir ve hem mikrodiseksiyon hem de aort kemerinin sonraki sabitleme için çok önemlidir. Bu protokoldeki bir sonraki kritik adım, aort kökünden seri bölümler koleksiyonudur. 80 her iki odak ve sabır gerektiren her fare için ardışık bölümler toplanmalıdır. Metodolojik yeterlilik açıklanan süreçleri önemli ölçüde hızlandırabilir. Yine de, aterosklerotik lezyon ölçümü hala zaman alan bir görevdir. Yeni teknoloji, otomatik taşıma ve küçük hayvan görüntüleme, gelecekte deneysel ateroskleroz miktarını kolaylaştırabilir. Aterosklerozun ilerlemesi yavaştır ve fare modellerinde en deneysel protokoller13tamamlamak için dört aydan fazla sürer. Bu nedenle, AAS çalışma uç noktalarında optimize edilmiş bir şekilde toplanması gerekir. Bu protokol, aort kökü, Aort kemer ve brachiocephalik arter lezyonunun ölçülmesini de dahil olmak üzere çok amaçlı kullanım için AAS hazırlar ve önerilen işleme, diseksiyonlarının verimli hasat için kapsamlı bir kılavuz sağlar. Umarım protokol deneysel değişkenliği azaltabilir, sonuçların güvenilirliğini artırabilir ve ateroskleroza karşı yeni tedaviler için yol açacak bulgulara yol açabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Göran K Hansson ‘ın son çeyrek yüzyıl boyunca bu protokolü geliştirmeye yardımcı olan deneysel kardiyovasküler araştırma biriminin tüm geçmiş üyelerine teşekkür ediyoruz. Özellikle Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson ve Inger Bodin ‘in katkıları için minnettarız. Bu çalışma, Isveç Araştırma Konseyi tarafından proje Grant 06816 ve Linnaeus destek 349-2007-8703 tarafından desteklenmektedir ve Isveçli kalp-akciğer Vakfı, Stockholm Ilçe Konseyi, Profesör Nanna Svartz Vakfı, Loo ve Hans Osterman gelen hibe tarafından Tıp Araştırmaları Vakfı, Karolinska Institutet ‘in Araştırma Vakfı ve Karolinska Institutet ‘te geriatrik hastalıklar Vakfı.

Materials

Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer – To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer – For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water – – For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH – Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100×20 mm) Any cell culture supplier – Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) – – Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL – trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Tags

AtherosclerosisMouse ModelsCardiovascular DiseaseAortic RootAortic ArchBrachiocephalic ArteryLesion Size QuantificationCryosectioningEn Face AnalysisAortaMicroscopyDissection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Centa, M., Ketelhuth, D. F., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image