JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

Published: June 12, 2019
doi:
10.3791/59828
, , ,
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine,Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine,University of Southern Denmark (SDU)

Summary

מודלים murine של טרשת עורקים הם כלים שימושיים כדי לחקור מסלולים פתוגניים ברמה מולקולרית, אבל דורשים קוונפיקציה סטנדרטית של פיתוח נגעים. פרוטוקול זה מתאר שיטה ממוטבת כדי לקבוע את גודל הנגעים בכלי העורקים העיקריים, כולל שורש אבי העורקים, קשת אבי העורקים, ועורק ברככתית.

Abstract

מחלת לב וכלי דם היא הגורם העיקרי למוות בעולם. הגורם הבסיסי ברוב המקרים הוא טרשת עורקים, אשר בחלק מחלה דלקתית כרונית. מחקרים כטרשת עורקים ניסויית הובהר את התפקיד של כולסטרול ודלקת בתהליך המחלה. זה הוביל ניסויים קליניים מוצלחים עם סוכני התרופות כי להפחית את הביטויים הקליניים של טרשת עורקים. ניסויים זהירים ומבוקרת היטב בדגמי העכבר של המחלה יכולים להבהיר עוד יותר את הפתוגנזה של המחלה, אשר אינו מובן במלואו. ניתוח הנגע מתוקננת חשוב להפחית את השונות הניסיונית ולהגדיל את התוכנות. קביעת גודל הנגע בשורש אבי העורקים, קשת אבי העורקים, ועורק ברכבעית הם נקודות קצה נפוצות ב טרשת עורקים ניסיוניים. פרוטוקול זה מספק תיאור טכני עבור הערכה של טרשת עורקים בכל האתרים האלה בעכבר אחד. הפרוטוקול שימושי במיוחד כאשר החומר מוגבל, כמו לעתים קרובות המקרה כאשר בעלי חיים מהונדסים גנטית מאופיינים.

Introduction

מחלות לב וכלי דם היא הגורם העיקרי של המוות בעולם עם מחלות לב האיסכמי שבץ וחשבונאות קו אחד בכל ארבעה מקרי מוות1. רוב המקרים נגרמים על ידי טרשת עורקים, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות איטית של לוחיות השומנים למעלה עם סימנים של דלקת כרונית בעורקים גדולים בגודל בינוני2. המחלה בדרך כלל נותרת בלתי מודעת במשך כמה עשורים עד קרע או שחיקה של הפלאק מעורר פקקת עורקים שמוביל נזק לרקמות.

עורק רגיל מורכב שכבה אינטימה עם תאים אנדותל ו בדלילות שרירים החלקה תאים, שכבת מדיה עם תאים שריר חלקה ולאמפיליות אלסטי, ושכבה האדואנבית שמסביב עם רקמת חיבור רופף3. שמירה של אינטימיות של הסטת LDL התפתחות טרשת עורקים4. הצטברות ושינוי של ליפופרוטאינים להוביל צבירה ומלכודת בתוך אינטימה העורקים5. תגובה דלקתית מעורר על ידי ליפופרוטאינים לכודים ושונה6. תאים אנדותל מתחילים לבטא מולקולות הדבקה, כגון VCAM-1 באתרים בעץ העורקים עם זרימת דם סוערת, המובילה לגיוס של מונוציטים במחזור ולוקיציטים אחרים7. החדירה מונוולוציטים הבדיל לתוך מקרופאגים כי ליפיד שומנים עם שלאחר השינוי מקרופאג בתאי קצף8.

טרשת עורקים נחקרו בדגמי העכבר עם תדירות גוברת מאז אמצע שנות ה-80. C57BL/6 הוא זן הנפוץ ביותר בשימוש בעכבר למחקרים אלה, והוא משמש כרקע גנטי עבור רוב זנים ששונו גנטית9. זן זה הוקם ב10של 1920, ואת הגנום שלה פורסם ב 200211. ניסויים במודלים של העכבר יש מספר יתרונות: המושבות לשכפל מהר, הדיור הוא יעיל בחלל, ו נישואים מפחית את השונות הניסיונית. המודל גם מאפשר מניפולציות גנטיות, כגון מחיקות גנים ממוקדות והחדרת הטרנסגנים. זה הוביל הבנה פתופסולוגית חדשה של המחלה ומטרות טיפול חדש12.

פראי סוג C57BL/6 עכברים הם עמידים באופן טבעי טרשת עורקים. יש להם את רוב הכולסטרול מחזורי ב-HDL, ו נגעים טרשת עורקים מורכבים אינם נוצרים גם כאשר הוזן גבוהה שומן וכולסטרול גבוה דיאטה13. עכברים Hypercholesterolemic, כגון apoe-/- על C57BL/6-רקע, משמשים אפוא מודלים ניסיוניים של טרשת עורקים14,15. חוסר ApoE פוגע ספיגת הכבד של ליפופרוטאינים שארית ומטבוליזם קשה perturbs שומנים. ב apoe-/- עכברים, במחזור הכולסטרול הוא בעיקר חלקיקים vldl, ואת העכברים לפתח שלטים טרשת עורקים מורכבים על דיאטה רגיל צ’או.

Ldlr-/- עכברים לחקות את ההתפתחות של טרשת עורקים לראות בבני אדם עם היפרכולסטרולמיה משפחתית16. Ldlr-/- עכברים צריכים סוג מערבי דיאט לפתח טרשת עורקים17. תזונה מערבית מחקה צריכת המזון האנושי ובדרך כלל מכיל 0.15% כולסטרול. קולטן LDL מזהה ApoB100 ו-ApoE ואת ספיגת המדיטים של חלקיקי LDL באמצעות אנדוקציטוזה. קולטני LDL הם בסיסיים לסיווג כבד של LDL ממחזור הדם, ואילו ביטוי קולטן LDL בתאים המטבטיים אינו משפיע על תהליך זה. זה פותח את האפשרות של השתלת מח עצם של Ldlr+/+ תאים לתוך hypercholesterolemic Ldlr-/- מקבלי הערכה של פיתוח טרשת עורקים. מח עצם הזמן השתמשו בדרך כלל כדי ללמוד את השתתפות של תאים המטבטיים ב טרשת עורקים ניסיוני. עם זאת, השתלת מח עצם יכול להשפיע על גודל והרכב של הפלאק טרשת עורקים, ביצוע פרשנות של תוצאות רב-משמעיים.

גרסאות שונות של apoe-/- ו Ldlr-/- עכברים עם שינויים גנטיים נוספים פותחו כדי ללמוד תהליכים ספציפיים של המחלה18. דוגמה אחת היא APOB100-transgenic Ldlr-/- (hubl) עכברים הנושאים את האדם באורך מלא APOB100 gene19,20. עכברים אלה לפתח היפרכולסטרולמיה טרשת עורקים על דיאטה רגיל צ’או. עם זאת, התפתחות של שלטים טרשת עורקים מורכבים לוקח לפחות שישה חודשים ופרוטוקולים ניסיוני קצר יותר להשתמש בדיאטה המערבית21. חלק גדול של כולסטרול פלזמה הוא במחזור חלקיקי ה-LDL, אשר נותן hubl עכברים יותר אנושי כמו dyslipidemic ליפופרוטאין פרופיל לעומת apoe-/- ו Ldlr– עכברים. עכברים Hubl גם לאפשר מחקרים של apob אנושי כמו אוטואנטיגן22.

מודלים של העכבר טרשת עורקים לפתח שלטים טרשת עורקים מורכבים עם תכונות משותפות של המחלה האנושית. עם זאת, הפלאק עמיד למדי לקרוע עם אוטם שריר הלב. “Atherothrombosis” מזוהה רק בכדי להעריך23,24,25. מודלים מיוחדים של קרע בפלאק פותחו, אבל השדה הנסיוני חסר מודל אמין ומלא לצורך הערכה של הפלאק ייצוב חומרים.

הקוונפיקציה של טרשת עורקים דווחה בדרכים רבות בספרות. מאמצים אחרונים ניסו לתקנן תכנון ניסיוני, ביצוע ודיווח על מחקרי בעלי חיים26. לחוקרים יש העדפות שונות וטכניקות המותאמות למעבדות שלהם. רוב פרוייקטי המחקר הם ייחודיים גם בדרך שהם דורשים כמה שינויים בפרוטוקול. בשל האופי הרב של המחלה, הפקדים האופטימליים משתנים בין פרוייקטים. תנאים מקומיים וחוסר סטנדרטיזציה עלולים לגרום להבדלים הנצפים בהתפתחות המחלה, אשר הסלים מתקדם בתחום המחקר. הבדלים בהבדלים ניסיוניים משמעו גם שחישובי כוח סטטיסטיים צריכים להיות מבוססים על לימודי פיילוט בתנאים מקומיים.

קוונפיקציה של טרשת עורקים מומלץ במספר מיקומים בעץ כלי הדם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג תוצאות של שורש אבי העורקים, את קשת אבי העורקים, ואת העורק הראשי בתוך בעכבר בודד, בנוסף לעזוב את שאר העורקים הבטן הת’ורבית לניתוחים אחרים. En ההכנות הפנים לאפשר כימות מהירה של שומנים למעלה הפלאק לאדן בקשת אבי העורקים. ניתן גם לכמת את נטל המחלה בעורקים הרכבתית אם הדגימות מוצגות בקפידה. זמן רב יותר לצרוך הצלבה של שורש אבי העורקים משאיר מספר סעיפים זמינים להערכה מפורטת של הרכב פלאק.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים דורשים אישור של רשויות אתיות. 1. הקרבת עכבר וניתוח מיקרו של העורקים להקריב את העכבר על ידי CO2 חנק ומשקל שיא. לרסס את העכבר עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום פרווה של דגימות. למקם את העכבר במצב פרקדן. מתוך חריץ הצוואר, לעשות חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים מאיו מאריך אותו כמעט עד עצם החיק.זהירות: האתנול אחוז גבוה הוא דליק מאוד והוא עלול לגרום לגירוי בעיניים חמורות. . נקוט באמצעי זהירות השתמש במחט של 23 גר’ כדי להשמיד את העכבר באמצעות ניקוב לב דרך הקיר בבית החזה. הליך זה בדרך כלל מניב 750 μL של דם מעכבר 20 שבועות. בדרך כלל, לאסוף חצי נפח בצינור EDTA שלוש אשלגן מצופה והחצי השני בסרום או שפופרת ליתיום הרין מצופה. הפעל בעדינות את הצינורות ושמור אותם בטמפרטורת החדר עד לעיבוד נוסף. השתמש מספריים מאיו לחתוך את צפק הדופן באמצע הדרך כדי לפתוח את חלל הבטן. להחזיק את התהליך xiphoid עם מלקחיים רקמות ולחתוך לפתוח את צפק צדדי משני הצדדים ולהמשיך לפתוח את הסרעפת. השתמש במספריים של מאיו כדי לפתוח את חלל החזה על ידי חיתוך דרך כלוב הצלעות ככל האפשר. זה יאפשר זוויות רחב עבור המכשירים בעוד מיקרו את העורקים בהמשך. לבצע חתך בתוך האוריקל הימני עבור ניקוז נוזל היתוך. הכנס מחט G 27 דרך קודקוד הלב בכיוון הגולגולת. לשמור את המחט קבוע בחדר השמאלי בזמן מבשם לאט לשרת את העכבר עם 10 מ”ל קר-הקרח מלח פוספט באגירה מלוחים (PBS) במהלך המינימום 2 דקות. להתבונן הכבד הסטה בצבע ומקבל paler.הערה: פרוטוקולים מסוימים משתמשים perfusion פרזיה, אבל זה מפריע עם כמה יישומים במורד הזרם, כגון ניתוח אימונוהיסטוכימיה של לימפוציטים. לכן, לא קיבעון היתוך עם פאראפורמלדהיד מבוצע בפרוטוקול זה. מנתחים איברי עניין (למשל בלוטות הלימפה, הטחול, הכבד, המעי, רפידות שומן אינרינליות, הכליות, וכו ‘) באמצעות מלקחיים אנטומיים ו המספריים מבתר. לחתוך את קנה הנשימה ואת הוושט בצד הימני של הלב מבלי לפגוע בקשת אבי העורקים. חותכים את הסרעפת ואת המבנים הטוב את מעיים המחשבה, ומשאירים את הלב, העורקים והכליות באתרו. מקפלים את הריאות ומעיים להתחמק ולכסות אותם עם מפית כדי להתחיל בניתוח מיקרו הצפק של בלוטות הלימפה פרה-העורקים ואת אבי העורקים הבטן. התחל בניתוח מיקרו מתחת לstereomicroscope בהגדלה של 6x. מתחילים לנתח את הבייון של אבי העורקים על ידי הרמת הרקמה שמסביב עם מלקחיים דומונט וחיתוך תחת מתח עם מספריים Vannas. המשיכו בניתוח של. עורק העורקים הבטני ולשחרר את אבי העורקים דרך. ההפסקה של אבי העורקים בסרעפתהערה: מיקרודיסקציה מחייבת תיאום מדויק של עין יד דרך הstereomicroscope, שלוקח קצת תרגול להתמחות. תסיר את רקמת השומן. שמכסה את העורקים החזי בזהירות בנתח דורסלי של התימוס כדי לשחרר את קשת אבי העורקים עם ענפים. המשיכו לבתר את העורקים הראשיים. באופן דיבאלי ככל האפשר בחלל החזה במקרים מיוחדים, ניתן לבצע את ניתוח הצוואר כדי לכלול את הבייון העורק. נקה את הכלים על ידי הרינסים רצופים במים מפוהים, RNase הטיהור פתרון, 70% אתנול, ו PBS לפני למעשה לחתוך את העורקים. הרם את הלב על ידי הקודקוד עם הלקחיים. . והניחו את כל הלב בצינור עם הערוץ הלב יכול להיות מאוחסן על הקרח למשך כמה שעות לפני המשך עיבוד הcryomounting שורש אבי העורקים. חותכים את קשת אבי העורקים. לפי איור 1 א שים את קשת אבי העורקים בצינור המכיל 1 מ ל 4% פורמלדהיד לילה ב 4 ° c. ניתן לאחסן את הדגימה באופן זה במשך כמה שנים לפני הצמדה וניתוח.זהירות: פורמלדהיד עלול לגרום לסרטן, אלרגיות התגובות לעור, והוא מזיק אם בלע. השתמש בציוד הגנה אישי כנדרש. נתח את העורקים היורדים הנותרים ולשים אותו בפתרון ייצוב RNA או להקפיא אותו עבור ניתוח RNA הבאים או יישום אחר. אופטימיזציה זרימת העבודה כדי למזער את זמן הניתוח הוא חיוני כדי למנוע השפלה RNA מוגזמת. שים את הצינורות של אוסף הדם (שנאספו בשלב 1.3) בצנטריפוגה. מסובבים את צינורות הפלזמה והנסיוב הנפרדים ב-1,500 x g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו בזהירות את הפלזמה ואת הנסיוב לצינורות המיקרוצנטריפוגה והחנות ב-80 ° c. איסוף הן פלזמה EDTA ו-heparinized או הסרום מותיר אפשרויות ליישומים מרובים במורד הזרם. הניחו את הלב על מיטת שעם עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. לתקן את הלב לפקק עם מחט דרך הקודקוד. להחזיק את בסיס הלב עם מלקחיים אנטומיים. השתמש אזמל לחתוך את פסגה 2/3 של הלב עם כיוון החתך להיות קו בין שתי האוריקלס עם אזמל בזווית 20 ° המקצץ במישור משונן ו 20 מעלות גולגולת במישור נוגדים (איור 1b). להטביע את שורש אבי העורקים במתחם החיתוך האופטימלי (OCT), המקיף, אך לא לחדור את הרקמה. לטבול את בסיס הלב במתחם OCT. לסחוט בעדינות את הלב עם מלקחיים כדי למלא את שורש אבי העורקים עם OCT ולהסיר כל בועות אוויר. להעביר את הדגימה לתחתית של הקפאה מלאה באוקטובר. שורש אבי העורקים צריך עכשיו. להיות מאונך למשטח התחתון שים את הלב רכוב על קרח יבש להקפיא. אחסן את הדגימות בשקיות zip ב-80 ° צ’ עד שהמרדף מכווץ לפי סעיף 3 בפרוטוקול זה. איור 1: שער הלב והאבי העורקים באתרו. (א) הריאות, קנה הנשימה, הוושט, ובלוטת התימוס יוסרו כדי להציג את קשת אבי העורקים באתרו של 20 שבועות בן נקבה apoe-/- עכבר על דיאטה רגיל צ’או במיקרוגרף, סרגל בקנה מידה = 2 מ”מ. הקווים המנוקדים מציינים היכן לגזור את קשת אבי העורקים ואת ענפיו. (ב) תיאור סכמטי של הלב והאב העורקים. הקו המנוקד באדום מציין היכן לחתוך את הלב לפני שcryomounting את שורש אבי העורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 2. ניתוח פנים של קשת אבי העורקים ועורק ברכסטאני הכינו מיטות הצמדה לניתוח פנים. של קשתות אבי העורקים מקפלים קטע של הסרט שעווה פרפין שמונה פעמים לעשות שטוח 25 מ”מ x 25 מ”מ משטח המשטח. עטוף את זה עם סרט בידוד חשמלי שחור כדי ליצור רקע כהה עבור העורקים. הצב תווית על החלק האחורי של מיטת ההצמדה והשתמש בעיפרון מוביל כדי לכתוב את מספר הזיהוי של העכבר (דיו העט הרגיל ייעלם בתהליך הצביעת). להעביר את קשת אבי העורקים אל מיטת ההצמדה ומניחים טיפה של ה-PBS על גבי זה. התחילו לנקות את העורקים מהרקמה הstereomicroscope. השתמש במספריים של Vannas ו מלקחיים של דומונט כדי לקלף בעדינות את כל רקמת השומן שמסביב מבלי לתמרן או לפגוע בעורקים. העירוי בסודאן יכתים את רקמת השומן במאור פנים, והוא חיוני להסיר את כל הרקמה הזאת בשלב זה.הערה: לשמור על העורקים לחות בכל עת החלת PBS נוספים בעת הצורך. לחתוך את אבי העורקים במישור הקורולי על ידי החדרת מספריים Vannas בתוך לומן אבי העורקים כדי לחשוף את משטח האינטימיות. התחילו לחתוך את העקמומיות החיצונית של הקשת העולה בכיוון המרוחק ולהמשיך לחתוך את הענפים כולל את עורק הרכבעית. חוס על החלק הגבי. של אזור החזה היורד לחתוך לפתוח את העקמומיות פחותה לקפל לפתוח את העורקים כדי להציג את משטח האינטימיות.הערה: שלב זה דורש מיומנויות מוטוריות עדין והוא זקוק לקצת תרגול כדי לשלוט. הצמד את הקשת הפתוחה למיטת ההצמדה בעזרת הקצה הקהה של סיכות החרק המינוטיים. השתמש במחזיק מחט מיקרו של קסטרוייחו כדי לשים את הפינים במקומם. כופף בעדינות את הפינים הרחק מן הדגימה כאשר הוא במקומו. להצמיד את העורקים שטוח על המיטה בלי למתוח את הדגימה. אחסן את הקשת המוצמדת הפונה כלפי מטה בצלחת פטרי מלאה ב-4 ° c.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. הכינו פתרון עבודה של סודאן IV. מערבבים 1 גרם של סודן אבקת IV, 100 mL של 70% אתנול, ו 100 mL של אצטון בבקבוק כהה מערבבים בעדינות עבור 10 דקות. אין צורך לסנן את הפתרון והוא יכול לשמש כמה חודשים אם המשיך להחשיך בטמפרטורת החדר. אם צבע הכתמים אינו משביע רצון, ניתן לעשות פתרון חדש והדגימות מוכתמות שוב.זהירות: אצטון הוא נוזל דליק שיכול לגרום לגירוי בעיניים רציניות. חנות במקום מאוורר היטב ולנקוט אמצעי זהירות בעת הטיפול. מסדרים חמש מנות פטרי על הספסל במעבדה: אחד מלא עם 70% אתנול, אחד מלא הרביעי בסודאן פתרון עבודה, שני מלא עם 80% אתנול, ואחד מלא עם PBS. התחל עם שטיפה את הדגימה ב 70% אתנול עבור 5 דקות על ידי הצבת מיטת ההצמדה בצלחת פטרי הראשון עם הקשת פונה כלפי מטה. העבר את הדגימה לפתרון הרביעי בסודאן לעבוד ולתת לו להכתים את הקשת 7 דקות. הבא, לשטוף ב 80% אתנול עבור 3 דקות פעמיים כדי להכתים את משטח האינטימיות הרגיל. ניתן לכוונן את זמן הביטול כדי למטב את התוצאות. לבסוף, לשטוף ב-PBS לפני לשים את הדגימה בחזרה צלחת פטרי המקורי. רוכשים מיקרוגרפים באמצעות stereomicroscope בהגדלה של 10 פעמים המחוברות למצלמה דיגיטלית. צלם את הקשת המוצמדת שקוע ב-PBS באמצעות משקולות מתכת קטנות (20 מ”מ x 10 מ”מ x 5 מ”מ) כדי להחזיק את מיטת ההצמדה לתחתית צלחת פטרי. הצב סרגל לצד העורקים לכיול התמונה. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה (לדוגמה ImageJ) כדי לקבוע את אזור הנגעים ואת משטח האינטימיות הכולל. בהעדר ציוני דרך אנטומיים להגדיר את קשת אבי העורקים, המדידה מבוצעת בדרך כלל מתחילת העורקים העולה למטה לסניף האינטרקוסטל הראשון (איור 2A). השתמש בתכונה כימות השטח בתוכנה כדי להקיף באופן ידני את אזור הקשת של אינטימיות מוחלטת.הערה: כימות הנגעים צריכות להיעשות בצורה עיוורת ורצוי שחוקר שני יאשר את התוצאות. ב-ImageJ, בחר בכלי בחירת המצולע והקיף את אזור הקשת הכולל בלחיצות חוזרות ונשנות. לאחר מכן בחרו מדידה בתפריט ‘ ניתוח ‘ כדי להציג את אזור הקשת הכולל בחלון התוצאה. לאחר מכן, להקיף את כל הפלאק סודן IV המוכתמת בקשת. סודן IV היא לצבוע ליסוכרום כי כתמי שומנים, טריגליצרידים, וליפופרוטאינים עם צבע כתום אדום. ב-ImageJ, בחרו בכלי בחירה ביד חופשית והמקיפים את כל הפלאק תוך כדי הקשה על מקש Alt. לחץ על מדידה בתפריט הניתוח כדי להציג אזור קשת נטול נגעים בחלון התוצאה. לחשב אזור נגע יחסית על ידי הפחתת אזור ללא נגע מאזור הקשת הכולל ולאחר מכן חלוקת התוצאה עם שטח הקשת הכולל. הצמד בזהירות את עורקי המשנה והעורק הראשי כדי לאפשר לכמת את הנגעים בעורק התחבורתי (איור 2 א). הקוונפיקציה של נגעים בעורקים ריחי ועורקים העורק המשותף הוא בדרך כלל מאוד מאתגר ולא משמעותי, בהתאמה. ב-ImageJ, יש להקיף את שני החלקים של עורק הראצי, באמצעות כלי בחירת המצולע תוך הקשה על מקש shift. לחצו על ‘ מדידה ‘ בתפריט ‘ ניתוח ‘ להצגת אזור העורק הכולל בחלון התוצאה. לאחר מכן, בחרו בכלי בחירה ביד חופשית והמקיפים את כל הפלאק בעורק הראשי תוך כדי הקשה על מקש Alt. לחץ על מדידה בתפריט הניתוח כדי להציג את אזור עורק העורקים הללא נגע בחלון התוצאה. לחשב אזור נגע יחסית על ידי הפחתת האזור ללא הנגע מאזור עורק הראשי הכולל ולאחר מכן חלוקת התוצאה עם אזור העורק הכללי הכולל. איור 2: כימות הנגעים טרשת עורקים. (א) שער של אבי העורקים מ 20 שבועות בן אדם APOB100-transgenic Ldlr-/- (hubl) עכבר המזון המערבי דיאט במשך עשרה שבועות מוצמד פתוח ומוכתם עבור לוחיות עשיר ליפיד עם סודן IV. סה כ שטח הקשת של אבי העורקים מחולקת עם קו מנוקד לבן במיקרו-גרף, סרגל קנה מידה = 2 מ”מ. הקווים המנוקדים בצבע צהוב מתווה את השטח הכולל של עורק הזרוע. (ב) שורש אבי העורקים בסעיף ב 400 יקרומטר מן הסינוס של אב העורקים ב 20 שבועות זכר Ldlr-/- העכבר הפד מערב דיאט במשך שמונה שבועות דמיינו במיקרוגרף, סרגל בקנה מידה = 500 יקרומטר. הקווים מנוקד במתאר שחור את האזור כולל הספינה ואת נגעים טרשת עורקים מוכתם עם שמן אדום O מקומי intima העורקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 3. הקפאה של שורש אבי העורקים הגדר את טמפרטורת קריוסטט ב-20 ° c ועובי המקטע עד 10 μm. הר את בלוק OCT המכיל את שורש אבי העורקים על מחזיק הדגימה עם הרקמה החדרית הפונה כלפי חוץ. כשאתה מתחיל לחתוך, כוונן בסדר את היישור של משטח המקטע כדי להיות מקביל למחזיק הדגימה. להסיר מוגזם מסביב OCT כדי להקל על איסוף מקטעים ללא קפלי. שורש אבי העורקים צריך כעת להיות ממוקם בניצב ללהב הסכין בהתחשב כי בסיס הלב הוצב נכון בתבנית. לאסוף מקטעי בקרה ראשונית על מגלשות מיקרוסקופ רגיל, אשר יימחקו. הסעיפים הראשונים צריכים להכיל רק רקמת שריר הלב. התקדמות הדירוג על ידי 200 יקרומטר באותו זמן. לאסוף מקטע ולבדוק את ההתקדמות עם מיקרוסקופ אור. כאשר מתקרבים למערכת השמאלית של החדר השמאלי, בדוק כל 100 יקרומטר מתחת למיקרוסקופ. כאשר סימנים ראשוניים של קיר כלי הם נצפו, להאט את הקצב כדי 50 μm.הערה: כאשר מופיע הקצה הראשון של אבי העורקים, זה יהיה נקודה אפס לאיסוף סעיפים. זה יכול להיות קשה לראות כאשר cusps מופיעים בדיוק, אבל לוקליזציה מדויקת היא חיונית כדי לבצע השוואות של נגעים באותו אזור. להטות את הדגימה לעבר נקודת אפס הקצה כדי ליישר את המטוס בסעיף עם שני האחרים. זה הכרחי להשגת חלק. מהצלב האמיתי של העורקים לעשות ציור של שורש אבי העורקים, המציין את cusps כפי שהם מופיעים, ולספור כל 10 יקרומטר מקטע כי הם חתוכים מנקודה אפס ואילך. כאשר הקצה השני מופיע, קצת להטות את הדגימה שוב הרחק מן הקצה כדי ליישר את הדגימה עם הקצה השלישי. ההפרש ברמה בין cusps לא צריך לחרוג 50 יקרומטר. התחל לאסוף מקטעים בשקופיות מרמה 90 יקרומטר ואילך. איסוף מקטעים בהתאם לתכנון השקופיות באיור 3. האוסף של סעיפים ניתן להתחיל מ 190 יקרומטר אם שורש אבי העורקים הוא יותר מ 50 יקרומטר מוטה, כדי לאפשר שטח נוסף כדי ליישר את השורש במצב ישר. המשך לעבור את הנקודות עד שתגיע לרמה 800 יקרומטר מנקודה אפס. אם עדיין יש שלטים גלויים ברמה זו, ניתן להרחיב את האוסף ל 1,000 μm.הערה: ארגון שקופיות מפושט מוצג בתרשים המשלים 1, שיכול להגדיל את מהירות האבטחה. יש להחליט על תכנון השקופיות האופטימלי בהתאם לתוכנית הפרוייקט. תקן את המקטעים לאחר האיסוף. תקן את הסעיפים שנאספו עבור שמן אדום כתמים ו Picrosirius כתמים אדומים של קולגן ב 4% פורמלדהיד עבור 10 דקות. לשטוף במים מוהים, יבש, ולאחסן בטמפרטורת החדר עד להמשיך עם סעיף 4 בפרוטוקול זה. אם שקופיות צריך להיות מוכתם עם שמן אדום O מיד ועדיין רטוב, למקם אותם 60% איזופנול עבור 1 דקות כדי להאיץ את תהליך הייבוש.זהירות: אלכוהול איזופרופיל הוא נוזל דליק שעלול לגרום לגירוי בעיניים חמורות ועלול לגרום לנמנום או סחרחורת. חנות במקום מאוורר היטב ולנקוט אמצעי זהירות בעת הטיפול. תיקונים בסעיפים שנאספו עבור אימונוהיסטוכימיה או אימונולובורנציה בקרח אצטון טהור במשך 10 דקות. יבש בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. החנות מקטעים ב-20 ° c. איור 3: ארגון השקופיות למקטעים סדרתיים של שורש אבי העורקים. במהלך ההקפאה של שורש אבי העורקים כל מקטע עבה 10 יקרומטר הפורש הראשון 800 יקרומטר של אבי העורקים העולה צריך להיות נאסף. יש צורך בארגון שקופית שיטתי להשגת מקטעים מתאימים ליישומים שונים. ניתוח של הרכב נגעים בדרך כלל כולל שמן אדום O כתמים עבור שומנים ו Picrosirius כתמים אדומים עבור קולגן. מקטעים נותרים נאספים ו אצטון-קבוע עבור אימונוהיסטוכימיה ו אימונוoforסנס כתמים. דמות זו שונתה מ-Gisterå ואח ’30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 4. שמן האדום כתמים ו קוונפיקציה של טרשת עורקים בשורשי אבי העורקים הכנת פתרון שמן בצבע אדום רווי על ידי המסת 1 גרם של שמן אדום O ב 100 mL של איזופנול. מערבבים את התמיסה בבקבוק כהה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את התמיסה הרוויה במשך מספר חודשים.הערה: מומלץ להיות ציוד מעבדה ייעודי עבור הצביעת שמן אדום O מאז קשה לנקות את הציוד כי כבר במגע עם הפתרון. הכנת פתרון עבודה על ידי ערבוב 75 mL של הפתרון שמן אדום רווי עם 50 mL של מים מלא מעובדים. בואו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לסנן דרך נייר סינון איכותני. מניחים את השקופיות ב שמן אדום O פתרון עבודה עבור 20 דקות. לשטוף את מי ברז עבור 5 דקות. לעזור להדמיה ברקמה, להכתים. עם המטלין של מאייר במשך 1 דקות לשטוף את מי הברז הפושרים למשך 5 דקות. גרעיני כל צריך עכשיו להיות מוכתם בצבע כחול, להתאים את הזמן מכתים כדי למטב את התוצאה. הר שקופיות בינונית הרכבה מימית (למשל, ג’לטין גליצרול של הקייזר). הג החמים של הקייזר מגיע ל-40 ° c כדי להפוך אותו לנוזל לפני השימוש. אין צורך לייבש את השקופיות מכיוון שהמדיום הגובר הוא מים מבוססים. להיזהר להימנע היווצרות בועות אוויר בעת הוספת זכוכית לכסות.זהירות: ג’לטין הגליצרול של הקייזר מכיל פנול, החשוד בגרימת פגמים גנטיים. השתמש בציוד הגנה אישי כנדרש. לרכוש מיקרוגרפים דיגיטליים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ אור. בדרך כלל חומת כלי מלא ואת גבולות הנגעים יכול להיות דמיינו בבירור על ידי 50 פעמים ההגדלה. שמור תמונות ברזולוציה גבוהה, רצוי בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF). לבצע ניתוח של גודל הנגע באמצעות מחשב בסיוע מערכת התוכנה ניתוח תמונה. שמן אדום O הוא צבע lysochrome כתמי שומנים ניטרליים לדמיין טרשת עורקים לוחות עם צבע אדום אינטנסיבי, אשר מסייע לכמת את הפצע.הערה: כימות הנגעים צריכות להיעשות בצורה עיוורת ורצוי שחוקר שני יאשר את התוצאות המתקבלות. השתמש בתכונת הכמת של האזור בתוכנת ניתוח התמונה כדי להגדיר את אזור הספינה הכולל על ידי המקיף את לאמינה אלסטי החיצוני של קיר כלי האבי העורקים (איור 2B). ב-ImageJ, בחר בכלי בחירת המצולע והקיף את האזור על-ידי לחיצות חוזרות. לאחר מכן בחרו מדידה בתפריט ‘ ניתוח ‘. אזור הספינה הכולל מוצג בחלון התוצאה. המשך לכמת את הנגעים הטרשת עורקים בשכבת האינטימיות של הכלי, המוגדר על ידי לאמינה האלסטי הפנימי וגבול הלומיאל. בדרך כלל נגעים בשסתומים. לא נכללים במדידה27 ב-ImageJ, בחרו בכלי בחירה ביד חופשית והמקיפים את כל הפלאק תוך כדי הקשה על מקש Alt. בחרו מדידה בתפריט ‘ ניתוח ‘ להצגת אזור כלי הקיבול ללא הנגע בחלון התוצאה. חשב את אזור הנגע היחסי על-ידי הפחתת האזור ללא הנגע מאזור הספינה הכולל ולאחר מכן חלוקת התוצאה באזור הכולל של כלי הקיבול.הערה: כיול את התוצאות בתוכנת ניתוח התמונה בהתאם להגדלה המשמשת להשגת אזור הנגע המוחלט במיקרומטר מרובע. הגדר את האזור שמן אדום ויטראז ‘ בנגעים באמצעות התכונה סף צבע בתוכנה ניתוח תמונה כדי לחשב את האחוזים של אזור הנפט האדום החיובי של אזור הנגע הכולל. ב-ImageJ, יש להקיף את כל אזור הנגע בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית תוך כדי הקשה על מקש shift. בחרו מדידה בתפריט ‘ ניתוח ‘ להצגת אזור הנגע הכולל בחלון התוצאה. בחרו ‘ נקה מחוץ לתפריט ‘ עריכה ‘. שינוי סוג התמונה ל-8 סיביות בתפריט תמונה. הגדר סף אדום לאזור שלילי “שמן אדום O” על-ידי בחירת הסף בתפריט המשנה התאם של מהתפריט תמונה. לחץ על החל. הפוך את התמונה לבינארית על-ידי בחירת אפשרות זו בתפריט המשנה הבינארי של תפריט התהליך.הערה: בדרך כלל שמן אדום כתמים משתנה בין אצוות. מכאן, צבע סף מומלץ רק בתוך אותה אצווה כתמים. יש להציג את התוצאה יחד עם תיאור האופן שבו הסף נקבע ומתוקננת. ניתוח התמונה על-ידי בחירה באפשרות ‘ ניתוח חלקיקים ‘ בתפריט ‘ ניתוח ‘ ולחץ על ‘ אשר ‘. כולל שמן אדום הנגע שלילי האזור מוצג כעת בחלון הסיכום. לחשב את השטח היחסי שמן אדום או חיובי על ידי הפחתת האזור האדום שלילי O הנפט מאזור הנגע הכולל ולאחר מכן חלוקה עם האזור נגעים הכולל.

Representative Results

בדגמי העכבר של טרשת עורקים הנגעים הבולטים ביותר נוטים להתפתח בשורש אבי העורקים וקשת אבי העורקים. פרוטוקול זה מתאר כימות טרשת עורקים בשורש אבי העורקים, קשת אבי העורקים, והעורק הראשי בעכבר בודד. נגעים מדידה בתוך החזה בסדר העורקים ואת אבי העורקים הבטן נמצאים רק בבעלי חיים עם מחלות מראש. בפרוטוקול זה, חלקים אלה אינם מנותח עבור נטל טרשת עורקים, אך נשמר עבור ניתוח עוקבות של רמות mRNA או ניתוחים אחרים. סעיפים סידוריים של נגעים טרשת עורקים בשורש אבי העורקים מוצגים בדרך כלל בגרף עם גודל הנגע על ציר yומרחק לסינוס האבי העורקים על ציר ה-x28. מחתך אמיתי הוא חיוני לכימות גודל הנגעים. מקטעים אלכסוניים יכולים להיות באופן מיותר בגודל של הנגעים והטיה של 20 ° בלבד יכול להיות באופן מושלם משטח נגע מוחלט על ידי 15. עם זאת, חישוב החלק הנגעים של אזור כולל כלי הקיבול הופך את התוצאה פחות רגיש להבדלים זווית אפשרית במהלך בנייה (איור 4A). שיטה סטטיסטית מתאימה לזיהוי הבדלים בין קבוצות היא בדרך כלל ניתוח שתי כיוון רגיל של סטיה (ANOVA). בונפררוני פוסט בדיקות מתבצעות אז כדי לזהות הבדלים ברמות מסוימות. ההבדל הפחות משמעותי של פישר יכול לשמש גם כמבחן מעקב ל-ANOVA. הוא מפחית את הסבירות של שגיאות סטטיסטיות מסוג II, אך אין להתחשב בהשוואות מרובות. בנוסף, זה יכול להיות להמחשה כדי לחשב את האזור תחת עקומת או את גודל הנגע הממוצע לכל עכבר ולהציג את הנתונים בעלילה נקודה כדי להמחיש עוד וריאציה בודדת בתוך הקבוצות (איור 4B). שמן אדום O הוא צבע מסיס שומן אדום בהיר, אשר כתמי שומנים ניטרליים. שומנים קוטביים בקרום התא אינם מוכתמים. שמן אדום כתמים ניתן לבצע על טרי, קפוא, או בדיקות קבוע, אבל לא על פרפין-מוטבע דגימות עקב הסרת שומנים בתהליך הנדרש היחידזציה. כימות של הצטברות השומנים המסיביות יכול להתבצע על ידי צבע סף אזור הנפט האדום החיובי של אזור הנגע הכולל (איור 4C). המטאוקסילין מייצרת כתמים כחולים של גרעיני תאים, העוזר להמחיש מורפולוגיה של הפלאק. העורקים הימניים והשמאליים בדרך כלל מתפצלים מאבי העורקים סביב 250 יקרומטר מתוך סינוס של אבי העורקים27, אשר לעתים קרובות חופפים עם הגדלים הבולטים ביותר של נגעים. חלקים צולבים מאזור זה מוצגים לעתים קרובות כתוצאות מייצגות (איור 4D). איור 4: נגעים טרשת עורקים בשורש אבי העורקים. (א) 23 שבועות מוח עצם הזכר המזון המערבי התזונה המערבית במשך שמונה שבועות הוערכו כדי לקבוע את ההשפעה של תאי T Smad7-לקויה על פיתוח טרשת עורקים. ניסיוני Ldlr-/- כימניות קיבל Cd4-היצורים+Smad7fl/fl מח עצם ושולטת קיבל Cd4-יצורים+Smad7fl/+ מח עצם. הגרף מראה כימות של אזור טרשת עורקים נגעים משמונה סעיפים רצופים, 100-800 יקרומטר מן הסינוס של אבי העורקים מוצג כחלק הנגעים של משטח הספינה סה כ (Cd4-היצורים+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-Smad7+fl/fl/Ldlr-/- n = 9, 2-way ANOVA עם מבחן post של bonferroni, גרף מראה ממוצע ± SEM, סוגריים מסולסלים מציינים רמת משמעות עבור השוואת הזנים). (ב) העלילה נקודה משולבת וגרף בר מראה את האזור ממוצע טרשת עורקים נגעים מתוך סעיפים השורש של אבי העורקים (Cd4-היצור+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 6, Cd4-יצור+Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n = 9, ה- t-test של הסטודנט) (C) חלק של שמן אדום ויטראז ‘ בנגעים (Cd4-היצורים+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-יצור+Smad7fl/חליל /Ldlr-/- n = 6, t-test של סטודנט, ns = לא משמעותי) (B-C) נקודות מייצגות עכברים בודדים ובארים מראה משמעות ± SEM. (ד) מיקרוגרפים נציג מראה שמן אדום O כתמים (באדום צבע) של שומנים ניטרליים בשורש אבי העורקים 300 יקרומטר מן הסינוס של אבי העורקים (50x הגדלה), סרגל קנה מידה = 500 יקרומטר. *p ≤ 0.05, * * *p ≤ 0.001. דמות זו שונתה מ-Gisterå ואח ’31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. שמן אדום O יכול לשמש עבור כתמים של פנים en הכין aortas, אבל הפרוטוקול הזה משתמש בסודאן IV, אחרת צבע diazo נוח מסיסים שומן. סודן הרביעי בבירור לדמיין טרשת עורקים לוחות בצבע כתום אדום על ידי צביעת שומנים, טריגליצרידים, וליפופרוטאינים. הסרת הרקע האפל בתמונות מייצגות של קשתות האבי העורקים הפנים יכול לשפר את התצוגה החזותית (איור 5A). בדרך כלל הנגע מופץ בדרך כלל בתוך קבוצות, המאפשר בדיקות סטטיסטיות עם t-test של הסטודנט בין קבוצות. העלילה נקודה המציגה הן עכברים בודדים ואת הממוצע, אשר מושווה בין קבוצות, היא דרך אינפורמטיבית להציג את התוצאות (איור 5B-C). מאחר והווריאציה בתוך קבוצות בדרך כלל שונה בין מיקומים בעץ כלי הדם, יש צורך בדרך כלל בחישובי צריכת חשמל נפרדים. וריאציה מיותרת ניתן למנוע על ידי מיומנות השיטה וסטנדרטיזציה פרוטוקול. השגת תוצאות משמעותיות סטטיסטית חשוב, אבל הרלוונטיות הביולוגית של הבדל נצפה תמיד צריך להיחשב גם. איור 5: נגעים טרשת עורקים בקשת אבי העורקים בעורק ברכבעית. (א) נציג בפנים מיקרוגרפים האבי העורקים עם שלטים מלאים השומנים מוכתם עם סודן IV (בצבע כתום) מ 20 שבועות עכברים ישנים האכילו את הדיאטה המערבית במשך עשרה שבועות, דמיינו יחד. סרגל בקנה מידה = 2 מ”מ. האדם APOB100- transgenic-/- (hubl) עכברים שימשו כפקדים ואת הקבוצה הניסיונית היתה מורכבת עכברים tcr-transgenic עם תאי T מגיבים LDL (BT1) crossbred עכברים hubl . (ב) טרשת עורקים נגעים בקשת אבי העורקים (hubl n = 10, BT1xHuBL n = 12; מבחן tשל הסטודנט). (ג) טרשת עורקים נגעים בעורק הראשי (hubl n = 8, BT1xHuBL n = 9, מבחן t-הסטודנט). (B-C) נקודות מייצגות עכברים בודדים, משמעות המייצגי פעילויות היא ± SEM. *p ≤ 0.05. דמות זו השתנתה מגיסטרזה ואח ’32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. משלים איור 1: ארגון אלטרנטיבי של שקופיות עבור סעיפים סדרתיים של שורש אבי העורקים. ארגון שקופיות פשוט ושיטתי לאיסוף מקטעים משורש אבי העורקים. האוסף מאפשר כתמים של שמן אדום או עבור שומנים ואימונוהיסטוכימיה או אימונוofor, כתמים. שקופיות ייעודיות עבור כתמים אדומים Picrosirius של קולגן מושמטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מחלות לב וכלי דם הוא הרוצח העיקרי בעולם ומדידות מניעה חדשה נדרשים2. מודלים של עכבר המחלה לספק פלטפורמה מקיפה לחקירת פתופסיולוגיה וטיפולים ניסיוניים13. מידת הקוונדות אמינה חיונית לגישה זו. עם זאת, שיטות קוונפיקציה שונות בין מעבדות. סטנדרטיזציה ואופטימיזציה כבר תהליך מתמשך מאז 1980 של13,27,33,34. שורשי אבי העורקים התפתחה כאתר הפופולרי ביותר לכמת טרשת עורקים ניסיוני. חלקים צולבים של שלטים מאפשרים השוואה בין היקף הפלאק לבין קבוצות. En ההכנות הפנים הם המועדף על כימות הנגעים בחלקים גדולים יותר של העורקים. השיטה הפנים מפעילה את כמות הפלאק ומאפשרת לכמת את הכיסוי בשטח הפלאק, אך לא לקחת את עובי הפלאק בחשבון. הרלוונטיות הביולוגית של הבדלים שנצפו מתימוכין על ידי תוצאות ברורות במקומות שונים בעץ כלי הדם. הערכת פיתוח טרשת עורקים במיקומים שונים מטפלת באפקטים אפשריים של אתר מסוים. ההשפעה של תאים מושתלים המטפאות על פיתוח טרשת עורקים ניתן להעריך hypercholesterolemic Ldlr-/- כימטיים. עם זאת, הקרנה כל הגוף משפיע על תהליך טרשת עורקים עם אפקטים ספציפיים לאתר. נגעים טרשת עורקים בולטים יותר מפותחים בשורש אבי העורקים, בעוד פיתוח נגעים מופחת נצפה בקשתות האבי העורקים35.

חשוב מכך, לא רק גודל הנגע צריך להיות ממוען במחקרים של טרשת עורקים ניסיוניים. הרכב הנגע הוא גם פרמטר מפתח. כמה תכונות פלאק הקשורים ביטויים של המחלה בבני אדם36. בנייה סדרתית של שורש אבי העורקים משאיר מספר סעיפים זמינים לניתוח קפדני של הרכב פלאק. קרע בפלאק בבני אדם מאופיין כיפה סיבי דק עם כמה תאים שריר חלק, התוכן קולגן דליל סימנים של דלקת בפלאק36. למרות הקרע בפלאק הוא אירוע נדיר בדגמי העכבר של טרשת עורקים, סמנים ליציבות פלאק הם אינפורמטיביים כדי להעריך. גישות טרנסלסטיות יכול לאשר ממצאים מכניסטיים מדגמי העכבר ולחשוף תכונות חשובות של מחלת האדם31. מצב דלקתי של שלטים טרשת עורקים יכול להיקבע על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיה של VCAM-1, MHC class II, מקרופאגים, ו לימפוציטים30. פרוטוקולים מסוימים להשתמש בסעיפים האורך במישור הטבעי של קשת אבי העורקים או את העורק ברכבעית למדידת גודל טרשת עורקים הנגע והרכב37. עם זאת, שיטה חלופית זו משאירה רק חלקים ספורים שניתן לנתח, המגבילים את יישומיה.

צעד קריטי ראשוני בפרוטוקול זה הוא היכולת לקצור aortas ביעילות. תיאום עין יד מתחת למיקרוסקופ דורש אימון והוא חיוני הן עבור ניתוח מיקרו והצמדה לאחר מכן של קשת אבי העורקים. השלב הקריטי הבא בפרוטוקול זה הוא האוסף של מקטעים סדרתיים משורש אבי העורקים. 80 סעיפים רציפים יש לאסוף עבור כל עכבר, אשר דורש הן מיקוד וסבלנות. מיומנות מתודולוגי יכולה להאיץ את התהליכים המתוארים באופן משמעותי. אף על פי כן, כימות הנגעים הטרשת עורקים. עדיין משימה גוזלת זמן טכנולוגיה חדשה, טיפול אוטומטי, הדמיה בעלי חיים קטנים עשוי להקל על כימות טרשת עורקים ניסיוניים בעתיד. ההתקדמות של טרשת עורקים הוא הפרוטוקולים הניסיוניים ביותר איטי וניסיוני בדגמי העכבר לוקח יותר מארבעה חודשים כדי להשלים13. לכן, יש לאסוף aortas באופן מיטבי בנקודות הקצה של הלמידה. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף למסוק aortas ביעילות והעיבוד המוצע מכין aortas לשימוש רב תכליתי כולל כימות הנגעים בשורש אבי העורקים, קשת אבי העורקים, ועורק ברכבעית. בתקווה הפרוטוקול יכול להפחית את ההבדלים הניסיוניים, לשפר את האמינות של תוצאות, ולהוביל ממצאים כי יהיה לסלול את הדרך עבור טיפולים חדשים נגד טרשת עורקים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי יחידת המחקר וכלי הדם הניסיוניים של גראן ק. הנסון, שסייעה לפתח את הפרוטוקול ברבע השנה החולפת. אנו אסירי תודה במיוחד על התרומות של אנטלינו ניקולו, שינחואה ג’ואו, אנה-קארין רוברטסון ונגר בודין. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הפרויקט 06816 ו Linnaeus תמיכה 349-2007-8703 ממועצת המחקר השבדית, ועל ידי מענקים מקרן לב-ריאות שוודית, מועצת מחוז סטוקהולם, פרופסור נאנה Svartz הקרן, לו והאנס אוסטרמן הקרן למחקר רפואי, קרן המחקר והקרן של המכון למחלות גריאטרי בקארלנסקה.

Materials

Acetone VWR Chemicals 20066.296 For fixation of sections for immunohistochemistry.
Black electrical insulation tape (50 mm wide) Any specialized retailer – To create pinning beds for aortic arches.
Centrifuge Eppendorf 5417C Benchtop microcentrifuge.
Cork board Any specialized retailer – For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Cryostat Thermo Scientific Microm HM 560 For serial cryosectioning of aortic roots.
Deionized water – – For rinsing and preparation of solutions.
Digital camera Leica Microsystems DC480 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections.
Dissecting scissors (10 cm, straight) World Precision Instruments 14393 For general dissection of organs.
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) World Precision Instruments 500341 For microdissection of aorta.
Ethanol 70% (v/v) VWR Chemicals 83801.290 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Ethanol absolute ≥99.8% VWR Chemicals 20821.310 Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool.
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) VWR Chemicals 9713.1000 Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
ImageJ NIH – Image analysis software.
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) World Precision Instruments 15915-G Used as anatomical forceps.
Isopropanol Merck 1096341011 Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness.
Kaiser's glycerol gelatine Merck 1092420100 Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects.
Light microscope Leica Microsystems DM LB2 For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs.
Mayer's hematoxylin Histolab 1820 Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation.
Mayo scissors (17 cm, straight) World Precision Instruments 501751-G For general dissection.
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) World Precision Instruments 503376 For pinning of aortic arches.
Microcentrifuge tubes Corning MCT-175-C Polypropylene microtubes with snaplock cap.
Microlance 3 needles, 23 gauge BD 300800 For blood collection.
Microlance 3 needles, 27 gauge BD 302200 For perfusion of mice.
Microvette 500 µL, K3 EDTA Sarstedt 20.1341.100 For blood collection.
Microvette 500 µL, Lithium Heparin Sarstedt 20.1345.100 For blood collection.
Minutien insect pins, 0.10 mm Fine Science Tools 26002-10 For pinning of aortic arches.
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount Histolab 45830 For embedding tissue.
Parafilm M Bemis PM992 Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches.
Petri dishes (100×20 mm) Any cell culture supplier – Proposed as a storage container for pinned aortas.
Phosphate buffered saline (PBS) – – Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice.
Qualitative filter paper (grade 1001) Munktell 120006 For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm).
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76106 For stabilization of RNA in tissue samples
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780 A surface decontamination solution that destroys RNases on contact.
Scalpel handle #3 (13 cm) World Precision Instruments 500236 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Standard scalpel blade #10 World Precision Instruments 500239 For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots.
Stereomicroscope Leica Microsystems MZ6 For dissection and en face documentation
Sudan IV Sigma-Aldrich S4261 Not classified as a hazardous substance or mixture.
Superfrost Plus microscope slides Thermo Scientific J1800AMNZ To collect aortic root sections.
Tissue forceps (15 cm) World Precision Instruments 501741-G For general dissection.
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) Sakura 4565 For embedding aortic roots in OCT.
Vannas scissors (8 cm, straight) World Precision Instruments 503378 For microdissection of aorta.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL – trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Tags

AtherosclerosisMouse ModelsCardiovascular DiseaseAortic RootAortic ArchBrachiocephalic ArteryLesion Size QuantificationCryosectioningEn Face AnalysisAortaMicroscopyDissection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Centa, M., Ketelhuth, D. F., Malin, S., Gisterå, A. Quantification of Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (148), e59828, doi:10.3791/59828 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image