Los modelos murinos de aterosclerosis son herramientas útiles para investigar vías patógenas a nivel molecular, pero requieren una cuantificación estandarizada del desarrollo de lesiones. Este protocolo describe un método optimizado para determinar el tamaño de la lesión en los vasos arteriales principales, incluyendo la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala.
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo. La causa subyacente en la mayoría de los casos es la aterosclerosis, que es en parte una enfermedad inflamatoria crónica. Estudios experimentales de aterosclerosis han aclarado el papel del colesterol y la inflamación en el proceso de la enfermedad. Esto ha llevado a ensayos clínicos exitosos con agentes farmacéuticos que reducen las manifestaciones clínicas de la aterosclerosis. Los experimentos cuidadosos y bien controlados en modelos de ratón de la enfermedad podrían dilucidar aún más la patogénesis de la enfermedad, que no se entiende completamente. El análisis estandarizado de lesiones es importante para reducir la variabilidad experimental y aumentar la reproducibilidad. Determinar el tamaño de la lesión en la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala son puntos finales comunes en la aterosclerosis experimental. Este protocolo proporciona una descripción técnica para la evaluación de la aterosclerosis en todos estos sitios con un solo ratón. El protocolo es particularmente útil cuando el material es limitado, como es frecuentemente el caso cuando se caracterizan animales modificados genéticamente.
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo con cardiopatía isquémica y accidente cerebrovascular que representan una de cada cuatro muertes1. La mayoría de los casos son causados por la aterosclerosis, una enfermedad caracterizada por una acumulación lenta de placas llenas de lípidos con signos de inflamación crónica en arterias grandes y medianas2. La enfermedad generalmente pasa desapercibida durante varias décadas hasta que una ruptura o erosión de la placa provoca una trombosis arterial que conduce a daño del tejido isquémico.
Una arteria normal consiste en una capa de intima con células endoteliales y células musculares lisas escasamente distribuidas, una capa mediacon células musculares lisas y lamelas elásticas, y una capa adventitativa circundante con tejido conectivo suelto 3. Una retención intimal de LDL compensa el desarrollo de aterosclerosis4. La acumulación y modificación de lipoproteínas conducen a la agregación y atrapamiento dentro de la intima arterial5. Una respuesta inflamatoria es evocada por las lipoproteínas atrapadas y modificadas6. Las células endoteliales comienzan a expresar moléculas de adhesión, como El VCAM-1 en sitios en elárbol arterial con flujo sanguíneo turbulento, lo que conduce al reclutamiento de monocitos circulantes y otros leucocitos 7. Los monocitos infiltrados se diferencian en macrófagos que envuelven lípidos con la transformación subsiguiente a las células de espuma de macrófagos8.
La aterosclerosis se ha estudiado en modelos de ratón con frecuencia creciente desde mediados de la década de 1980. C57BL/6 es la cepa de ratón endogámica más utilizada para estos estudios, y se utiliza como antecedentes genéticos para la mayoría de las cepas modificadas genéticamente9. Esta cepa fue establecida en la década de 192010,y su genoma fue publicado en 200211. Los experimentos en modelos de ratón tienen varios beneficios: las colonias se reproducen rápidamente, la vivienda es eficiente en el espacio y la endogamia reduce la variabilidad experimental. El modelo también permite manipulaciones genéticas, como deleciones genéticas dirigidas e inserción de transgenes. Esto ha llevado a una nueva comprensión fisiológica de la enfermedad y nuevas metas de terapia12.
Los ratones C57BL/6 de tipo salvaje son naturalmente resistentes a la aterosclerosis. Tienen la mayor parte del colesterol circulante en HDL, y lesiones ateroscleróticas complejas no se forman incluso cuando se alimentan de una dieta alta en grasas y colesterol13. Por lo tanto, los ratones hipercolesterolémicos, como Apoe-/- en el fondo C57BL/6, se utilizan como modelos experimentales de aterosclerosis14,15. La falta de ApoE afecta la absorción hepática de lipoproteínas remanentes y perturba gravemente el metabolismo de los lípidos. En los ratones Apoe-/-, el colesterol circulante es predominantemente en partículas vLDL, y los ratones desarrollan placas ateroscleróticas complejas en una dieta regular para la dieta.
Ldlr-/- ratones imitan el desarrollo de aterosclerosis visto en humanos con hipercolesterolemia familiar16. Los ratones Ldlr-/- necesitan una dieta de tipo occidental para desarrollar aterosclerosis17. La dieta occidental imita la ingesta de alimentos humanos y generalmente contiene 0.15% colesterol. El receptor LDL reconoce ApoB100 y ApoE y media la aceptación de partículas LDL a través de la endoocitosis. Los receptores LDL son fundamentales para el aclaramiento hepático de LDL de la circulación, mientras que la expresión del receptor LDL en las células hematopoyéticas no influye en este proceso. Esto abre la posibilidad de trasplante de médula ósea de células Ldlr+/+ en receptores hipercolesterolémicos de Ldlr-/- y evaluación del desarrollo de aterosclerosis. Las quimeras de médula ósea se han utilizado comúnmente para estudiar la participación de células hematopoyéticas en la aterosclerosis experimental. Sin embargo, el trasplante de médula ósea podría influir en el tamaño y la composición de las placas ateroscleróticas, haciendo que la interpretación de los resultados sea ambigua.
Se han desarrollado diferentes variantes de ratones Apoe-/- y Ldlr-/- con alteraciones genéticas adicionales para estudiar procesos específicos de la enfermedad18. Un ejemplo son los ratones humanos APOB100-Ldlr transgénico -/- (HuBL) que llevan el gen APOB100 humano de longitud completa19,20. Estos ratones desarrollan hipercolesterolemia y aterosclerosis en una dieta regular para hacer comidas. Sin embargo, el desarrollo de placas ateroscleróticas complejas toma al menos seis meses y protocolos experimentales más cortos suelen utilizar la dieta occidental21. Una gran fracción del colesterol plasmático está circulando en partículas LDL, lo que da a los ratones HuBL un perfil de lipoproteína disfidemiadilo más humana en comparación con apoe-/- y Ldlr-/- ratones. Los ratones HuBL también permiten estudios de apoB humano como un autoantígeno22.
Los modelos de ratón de aterosclerosis desarrollan placas ateroscleróticas complejas con características compartidas de la enfermedad humana. Sin embargo, las placas son bastante resistentes a la ruptura con el infarto de miocardio subsiguiente. La aterocrobosis sólo se detecta esporádicamente y se desafia experimentalmente para evaluar23,24,25. Se han desarrollado modelos especiales de ruptura de placas, pero el campo experimental carece de un modelo fiable y reproducible para la evaluación de los agentes estabilizadores de placas.
Cuantificación de la aterosclerosis se ha divulgado de muchas maneras en la literatura. Los esfuerzos recientes han tratado de estandarizar el diseño experimental, la ejecución y la presentación de informes de estudios en animales26. Los investigadores tienen diferentes preferencias y técnicas adaptadas a sus laboratorios. La mayoría de los proyectos de investigación también son únicos de una manera que requieren algunas modificaciones de protocolo. Debido a la naturaleza multifactorial de la enfermedad, los controles óptimos varían entre los proyectos. Las condiciones locales y la falta de estandarización pueden causar diferencias observadas en el desarrollo de la enfermedad, lo que dificulta los avances en el campo de la investigación. Las diferencias en la variabilidad experimental también significan que los cálculos estadísticos de potencia deben basarse en estudios piloto en condiciones locales.
La cuantificación de la aterosclerosis se recomienda en varios lugares del árbol vascular. Este protocolo describe cómo obtener resultados de la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala en un solo ratón, además de dejar el resto de la aorta toracoabdominal para otros análisis. Las preparaciones faciales permiten una cuantificación rápida de las placas cargados de lípidos en el arco aórtico. La carga de enfermedad en la arteria braquiocéfala también se puede cuantificar si los especímenes se muestran cuidadosamente. El corte transversal más lento de la raíz aórtica deja varias secciones disponibles para la evaluación detallada de la composición de la placa.
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de mortalidad en el mundo y se necesitan nuevas mediciones preventivas2. Los modelos de ratón de la enfermedad proporcionan una plataforma integral para la investigación de la fisiopatología y los tratamientos experimentales13. La cuantificación fiable del tamaño de la lesión es esencial para este enfoque. Sin embargo, los métodos de cuantificación difieren entre laboratorios. La estandarización y optimización han sido un proceso continuo desde losaños 13,27,33,34. Raíces aórticas han surgido como el sitio más popular para cuantificar la aterosclerosis experimental. Las secciones transversales de las placas permiten comparar el volumen de placa entre grupos. Los preparados faciales en son favorecidos para la cuantificación de lesiones en segmentos más grandes de la aorta. El método en face visualiza la cantidad de placa y permite cuantificar la cobertura del área de placa, pero no tiene en cuenta el grosor de la placa. La relevancia biológica para las diferencias observadas está corroborada por resultados coherentes en diferentes lugares del árbol vascular. La evaluación del desarrollo de aterosclerosis en diferentes ubicaciones aborda los posibles efectos específicos del sitio. El efecto de las células hematopoyéticas trasplantadas en el desarrollo de la aterosclerosis se puede evaluar en quimeras hipercolesterolémicas de Ldlr-/- . Sin embargo, la irradiación de todo el cuerpo afecta el proceso de aterosclerosis con efectos específicos del sitio. Las lesiones ateroscleróticas más prominentes se desarrollan en la raíz aórtica, mientras que el desarrollo reducido de lesiones se observa en arcos aórticos35.
Es importante destacar que no sólo el tamaño de la lesión debe abordarse en estudios de aterosclerosis experimental. La composición de la lesión también es un parámetro clave. Varias características de la placa se han asociado con manifestaciones de la enfermedad en los seres humanos36. El seccionamiento en serie de la raíz aórtica deja varias secciones disponibles para un análisis cuidadoso de la composición de la placa. La ruptura de la placa en los seres humanos se caracteriza por una fina tapa fibrosa con pocas células musculares lisas, contenido de colágeno disperso y signos de inflamación en las placas36. Aunque la ruptura de la placa es un evento raro en los modelos de ratón de aterosclerosis, los marcadores para la estabilidad de la placa son informativos de evaluar. Los enfoques traslacionales podrían confirmar los hallazgos mecanicistas de los modelos de ratón y descubrir características importantes de la enfermedad humana31. El estado inflamatorio de las placas ateroscleróticas podría determinarse mediante la tinción inmunohistoquímica de VCAM-1, MHC clase II, macrófagos y linfocitos30. Algunos protocolos utilizan secciones longitudinales en el plano coronal del arco aórtico o la arteria braquiocéfala para medir el tamaño de la lesión aterosclerótica y la composición37. Sin embargo, este método alternativo deja sólo algunas secciones a analizar, lo que limita sus aplicaciones.
Un paso crítico inicial en este protocolo es la capacidad de cosechar aortas de manera eficiente. La coordinación mano-ojo bajo el microscopio requiere práctica y es crucial tanto para la microdisección como para la posterior fijación del arco aórtico. El siguiente paso crítico en este protocolo es la colección de secciones seriales de la raíz aórtica. Ochenta secciones consecutivas deben ser recogidas para cada ratón, lo que requiere tanto enfoque como paciencia. La competencia metodológica podría acelerar considerablemente los procesos descritos. Sin embargo, la cuantificación de lesiones ateroscleróticas sigue siendo una tarea que requiere mucho tiempo. La nueva tecnología, el manejo automatizado y las imágenes de animales pequeños podrían facilitar la cuantificación de la aterosclerosis experimental en el futuro. La progresión de la aterosclerosis es lenta y la mayoría de los protocolos experimentales en los modelos de ratón tardan más de cuatro meses en completar13. Por lo tanto, las aortas deben recopilarse de forma optimizada en los puntos finales de estudio. Este protocolo proporciona una guía completa para cosechar aortas de manera eficiente y el procesamiento propuesto prepara aortas para uso multiusos, incluida la cuantificación de lesiones en la raíz aórtica, el arco aórtico y la arteria braquiocéfala. Esperemos que el protocolo pueda reducir la variabilidad experimental, mejorar la fiabilidad de los resultados y dar lugar a hallazgos que allanarán el camino para nuevos tratamientos contra la aterosclerosis.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos los miembros anteriores de la unidad de investigación cardiovascular experimental de Géran K Hansson que ayudó a desarrollar este protocolo en el último cuarto de siglo. Agradecemos especialmente las contribuciones de Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson e Inger Bodin. Este trabajo fue apoyado por la concesión del proyecto 06816 y linneo apoyaron 349-2007-8703 del Consejo Sueco de Investigación, y por subvenciones de la Fundación Sueca Heart-Lung, el Consejo del Condado de Estocolmo, la Fundación Profesora Nanna Svartz, Loo y Hans Osterman Fundación para la Investigación Médica, Fundación de Investigación de Karolinska Institutet y Fundación para Enfermedades Geriátricas en Karolinska Institutet.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |