एथेरोस्क्लेरोसिस के Murine मॉडल एक आणविक स्तर पर रोगजनक रास्ते की जांच करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं, लेकिन घाव विकास के मानकीकृत परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल महाधमनी जड़, महाधमनी चाप, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी सहित प्रमुख धमनी वाहिकाओं में घाव के आकार को निर्धारित करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है।
हृदय रोग दुनिया में मौत का मुख्य कारण है। ज्यादातर मामलों में अंतर्निहित कारण एथेरोस्क्लेरोसिस है, जो एक पुरानी सूजन बीमारी के हिस्से में है। प्रायोगिक atherosclerosis अध्ययन रोग की प्रक्रिया में कोलेस्ट्रॉल और सूजन की भूमिका स्पष्ट है. यह दवा एजेंटों है कि atherosclerosis के नैदानिक अभिव्यक्तियों को कम के साथ सफल नैदानिक परीक्षण करने के लिए नेतृत्व किया गया है. रोग के माउस मॉडल में सावधान और अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगों से रोग के रोगजनन को और स्पष्ट किया जा सकता है, जो पूरी तरह से समझ में नहीं आता है। मानकीकृत घाव विश्लेषण प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और पुन: उत्पादन क्षमता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। महाधमनी जड़, महाधमनी चाप, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में घाव के आकार का निर्धारण प्रयोगात्मक एथेरोस्क्लेरोसिस में आम समापन बिंदु हैं। इस प्रोटोकॉल एक ही माउस में इन सभी साइटों पर atherosclerosis के मूल्यांकन के लिए एक तकनीकी विवरण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है जब सामग्री सीमित है, के रूप में अक्सर मामला है जब आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों की विशेषता जा रहा है.
हृदय रोग दुनिया में मृत्यु का मुख्य कारण है जिसमें इस्कीमिक हृदयरोग और स्ट्रोक प्रत्येक चार मौतों में से एक है . अधिकांश मामले एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण होते हैं, एक बीमारी जो बड़े और मध्यम आकार की धमनियों2में पुरानी सूजन के लक्षण के साथ लिपिड-ललित प्लेक के धीमी गति से निर्माण की विशेषता है। यह रोग आमतौर पर कई दशकों तक किसी का ध्यान नहीं रहता है जब तक कि प्लेक का टूटना या क्षरण एक धमनी थ्रोम्बोसिस को उजागर नहीं करता है जो इस्कीमिक ऊतक क्षति की ओर जाता है।
एक सामान्य धमनी endothelial कोशिकाओं और विरल वितरित चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ एक intima परत के होते हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और लोचदार पटल के साथ एक मीडिया परत, और ढीला संयोजी ऊतक के साथ एक आसपास के adventital परत3. एलडीएल की एक आंत प्रतिधारण atherosclerosis विकास4ऑफसेट . लिपोप्रोटीन का संचय और संशोधन धमनी के भीतर एकत्रीकरण और जाल को जन्म देताहै 5. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया फंस और संशोधित लिपोप्रोटीन6द्वारा पैदा की है. Endothelial कोशिकाओं आसंजन अणुओं को व्यक्त करने के लिए शुरू, इस तरह के अशांत रक्त प्रवाह के साथ धमनी के पेड़ में साइटों पर VCAM-1 के रूप में, एक कोशिका कोशिकाओं और अन्य ल्यूकोसाइट्स7घूम की भर्ती के लिए अग्रणी . घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स मैक्रोफेज में अंतर करते हैं जो लिपिड को आगामी परिवर्तन के साथ मैक्रोफेज फोम कोशिकाओं8में छा जाते हैं .
Atherosclerosis 1980 के दशक के मध्य के बाद से बढ़ती आवृत्ति के साथ माउस मॉडल में अध्ययन किया गया है. C57BL/6 इन अध्ययनों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया inbred माउस तनाव है, और यह आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में आनुवंशिक पृष्ठभूमि के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित9. यह विकृति सन् 1920 के10में स्थापित की गई थी और इसका जीनोम 200211में प्रकाशित हुआ था . माउस मॉडल में प्रयोगों के कई लाभ हैं: कालोनियों तेजी से पुन: पेश, आवास अंतरिक्ष कुशल है, और inbreeding प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है. मॉडल भी आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है, इस तरह के लक्षित जीन विलोपन और transgenes के डालने के रूप में. इससे रोग की नई समझ और नए चिकित्सा लक्ष्य12.
जंगली प्रकार C57BL/6 चूहों स्वाभाविक रूप से atherosclerosis के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. वे एचडीएल में घूम कोलेस्ट्रॉल के सबसे अधिक है, और जटिल atherosclerotic घावों का गठन नहीं कर रहे हैं यहां तक कि जब एक उच्च वसा और उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार खिलाया13. हाइपरकोलेस्टेरॉलमिक चूहों, जैसे Apoe-/- C57BL/6-पृष्ठभूमि पर, इसलिए atherosclerosis14,15के प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। ApoE की कमी अवशेष लिपोप्रोटीन के यकृत तेज और गंभीर रूप से परेशान लिपिड चयापचय ख़राब करता है। Apoeमें – / – चूहों, घूम कोलेस्ट्रॉल VLDL कणों में मुख्य रूप से है, और चूहों एक नियमित चाउ आहार पर जटिल atherosclerotic प्लेक का विकास.
Ldlr-/- चूहों पारिवारिक hypercholesterolemia16के साथ मनुष्यों में देखा atherosclerosis के विकास की नकल . Ldlr-/- चूहों atherosclerosis17विकसित करने के लिए एक पश्चिमी प्रकार के आहार की जरूरत है. पश्चिमी आहार मानव भोजन का सेवन नकल करता है और आमतौर पर 0.15% कोलेस्ट्रॉल होता है। एलडीएल रिसेप्टर ApoB100 और ApoE पहचानता है और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से एलडीएल कणों के तेज मध्यस्थता. एलडीएल रिसेप्टर्स परिसंचरण से एलडीएल के जिगर निकासी के लिए मौलिक हैं, जबकि hematopoietic कोशिकाओं में एलडीएल रिसेप्टर अभिव्यक्ति इस प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है. यह Ldlrकी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए संभावना को खोलता है + / + कोशिकाओं hypercholesterolemic Ldlrमें – / अस्थि मज्जा chimeras आमतौर पर प्रयोगात्मक atherosclerosis में hematopoietic कोशिकाओं की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण atherosclerotic प्लेक के आकार और संरचना को प्रभावित कर सकता है, परिणामों की व्याख्या अस्पष्ट बना.
रोग की विशिष्ट प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ एपो-/- और एलडीआर-/- चूहों के विभिन्न प्रकार विकसित किए गए हैं। इसका एक उदाहरण है मानव APOB100-ट्रांसजेनिक Ldlr-/- (HuBL) चूहे जो पूर्ण लंबाई वाले मानव APOB100 जीन19,20ले जाते हैं . इन चूहों एक नियमित चाउ आहार पर hypercholesterolemia और atherosclerosis का विकास. हालांकि, जटिल एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक के विकास में कम से कम छह महीने लगते हैं और कम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आमतौर पर पश्चिमी आहार21का उपयोग करते हैं। प्लाज्मा कोलेस्ट्रॉल का एक बड़ा अंश एलडीएल कणों में घूम रहा है, जो HuBL चूहों एक अधिक मानव की तरह dyslipidemic lipoप्रोटीन प्रोफ़ाइल Apoe की तुलना में देता है -/- और Ldlr-/- चूहों. HuBL चूहों भी एक autoantigen22के रूप में मानव apoB के अध्ययन की अनुमति .
एथेरोस्क्लेरोसिस के माउस मॉडल मानव रोग की साझा विशेषताओं के साथ जटिल एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक विकसित करते हैं। हालांकि, प्लेक आगामी मायोकार्डियल इंफार्क्शन के साथ टूटना के लिए काफी प्रतिरोधी हैं। एथेरोट्रोम्बोसिस केवल छिटपुट रूप से पता लगाया जाता है और23,24,25का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक रूप से चुनौतीपूर्ण है . प्लेक टूटना के विशेष मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन प्रयोगात्मक क्षेत्र में प्लेक स्थिर एजेंटों के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य मॉडल का अभाव है।
साहित्य में एथेरोस्क्लेरोसिस की मात्रा कई मायनों में बताई गई है। हाल के प्रयासों ने प्रायोगिक डिजाइन, निष्पादन, और पशु अध्ययन की रिपोर्टिंग26के मानकीकरण की कोशिश की है। अन्वेषकों विभिन्न वरीयताओं और तकनीकों को अपनी प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूलित किया है. अधिकांश अनुसंधान परियोजनाओं को भी एक तरीका है कि वे कुछ प्रोटोकॉल संशोधनों की आवश्यकता में अद्वितीय हैं. रोग की बहुकारक प्रकृति के कारण, इष्टतम नियंत्रण परियोजनाओं के बीच भिन्न होते हैं। स्थानीय परिस्थितियों और मानकीकरण की कमी रोग के विकास में देखा मतभेद हो सकता है, जो अनुसंधान क्षेत्र के अग्रिमों में बाधा. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता में अंतर भी है कि सांख्यिकीय शक्ति गणना स्थानीय परिस्थितियों के तहत पायलट अध्ययन के आधार पर किया जाना चाहिए मतलब है.
संवहनी पेड़ में कई स्थानों पर एथेरोस्क्लेरोसिस की मात्रा की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे महाधमनी जड़ से परिणाम प्राप्त करने के लिए, महाधमनी चाप, और एक माउस में ब्रैकियोसेफेलिक धमनी, अन्य विश्लेषण के लिए thoracoपेटपेट महाधमनी के बाकी छोड़ने के अलावा. चेहरा तैयारियों से महाधमनी चाप में लिपिड से लदी प्लेक का तेजी से परिमाणीकरण हो जाता है। यदि नमूनों को सावधानीपूर्वक प्रदर्शित किया जाता है तो ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में रोग के बोझ को भी निर्धारित किया जा सकता है। महाधमनी रूट के पार-सेक्शन करने में अधिक समय लगता है, प्लेक संरचना के विस्तृत मूल्यांकन के लिए उपलब्ध कई वर्गों को छोड़ देता है।
हृदय रोग दुनिया में मुख्य हत्यारा है और नए निवारक माप2की जरूरत है . रोग के माउस मॉडल पैथोफिजियोलॉजी और प्रयोगात्मक उपचार13की जांच के लिए एक व्यापक मंच प्रदान करते हैं । विश्वसनीय घाव आकार परिमाणीकरण इस दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है. तथापि, परिमाणीकरण विधियों में प्रयोगशालाओं के बीच अंतर है। मानकीकरण और अनुकूलन 1980 के13,27,33,34के बाद से एक सतत प्रक्रिया रही है . महाधमनी जड़ों प्रयोगात्मक atherosclerosis मात्रा के लिए सबसे लोकप्रिय साइट के रूप में उभरा है. प्लेक के क्रॉस-सेक्शन समूहों के बीच प्लेक वॉल्यूम की तुलना को सक्षम करते हैं। सामना की तैयारी महाराष्ट्रीयन के बड़े क्षेत्रों में घाव परिमाणीकरण के लिए अनुकूल हैं। एन फेस विधि प्लेक मात्रा की कल्पना करती है और प्लेक क्षेत्र कवरेज के परिमाणीकरण को सक्षम करती है, लेकिन खाते में प्लेक मोटाई न लें। मनाया मतभेदों के लिए जैविक प्रासंगिकता संवहनी पेड़ में विभिन्न स्थानों पर सुसंगत परिणामों द्वारा पुष्टि की है. विभिन्न स्थानों पर atherosclerosis विकास का मूल्यांकन संभव साइट विशिष्ट प्रभाव पते. एथेरोस्क्लेरोसिस विकास पर प्रतिरोपित हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन हाइपरकोलेस्टेरॉलर्मिक एल्डलर-/- चिमेरास में किया जा सकता है। हालांकि, पूरे शरीर विकिरण साइट विशिष्ट प्रभाव के साथ atherosclerosis प्रक्रिया को प्रभावित करता है. महाधमनी जड़ में अधिक प्रमुख एथेरोस्क्लेरोटिक घाव विकसित होते हैं, जबकि कम घाव विकास महाधमनी मेहराब35में मनाया जाता है।
महत्वपूर्ण बात यह है कि न केवल घाव आकार प्रयोगात्मक atherosclerosis के अध्ययन में संबोधित किया जाना चाहिए. लेसन संरचना भी एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. मानव में रोग की अभिव्यक्ति के साथ कई पट्टिका विशेषताएं जुड़ी हुईहैं . महाधमनी जड़ के सीरियल सेक्शनिंग प्लेक संरचना के सावधान विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई वर्गों को छोड़ देता है। मनुष्यों में फलक टूटना कुछ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, विरल कोलेजन सामग्री और प्लेक36में सूजन के लक्षण के साथ एक पतली रेशेदार टोपी की विशेषता है। हालांकि पट्टिका टूटना atherosclerosis के माउस मॉडल में एक दुर्लभ घटना है, पट्टिका स्थिरता के लिए मार्करों का मूल्यांकन करने के लिए जानकारीपूर्ण हैं. अनुवादात्मक दृष्टिकोण माउस मॉडलों से मशीनी निष्कर्षों की पुष्टि कर सकता है और मानव रोग की महत्वपूर्ण विशेषताओं को उजागर कर सकताहै 31. एथेरोस्क्लेरोटिक प्लेक की सूजन स्थिति वीसीएएम-1, एमएचसी श्रेणी द्वितीय, मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइट30साइटों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के दाग द्वारा निर्धारित की जा सकती है। कुछ प्रोटोकॉल महाधमनी चाप के कोरोनल तल में अनुदैर्घ्य खंडों का प्रयोग करते हैं या एथेरोस्क्लेरोटिक घाव के आकार और संरचना37को मापने के लिए ब्रैकियोसेफेलिक धमनी का उपयोग करते हैं . हालांकि, इस वैकल्पिक विधि का विश्लेषण किया जा करने के लिए केवल कुछ वर्गों छोड़ देता है, जो अपने अनुप्रयोगों को सीमित करता है.
इस प्रोटोकॉल में एक प्रारंभिक महत्वपूर्ण कदम कुशलता से aortas फसल की क्षमता है. माइक्रोस्कोप के तहत हाथ से आँख समन्वय अभ्यास की आवश्यकता है और दोनों microdissection और महाधमनी चाप के बाद pinning के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल में अगले महत्वपूर्ण कदम महाधमनी जड़ से सीरियल वर्गों का संग्रह है. अस्सी लगातार वर्गों प्रत्येक माउस, जो दोनों ध्यान और धैर्य की आवश्यकता के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. मेथोलॉजिकल प्रवीणता वर्णित प्रक्रियाओं को काफी गति दे सकती है। फिर भी, atherosclerotic घाव परिमाणीकरण अभी भी एक समय लेने वाली काम है. नई तकनीक, स्वचालित हैंडलिंग, और छोटे पशु इमेजिंग भविष्य में प्रयोगात्मक atherosclerosis के परिमाणीकरण की सुविधा हो सकती है. एथेरोस्क्लेरोसिस की प्रगति धीमी है और माउस मॉडल में अधिकांश प्रायोगिक प्रोटोकॉलों को13को पूरा होने में चार महीने से अधिक का समय लगता है . इसलिए, aortas अध्ययन समापन बिंदु पर एक अनुकूलित तरीके से एकत्र करने की जरूरत है. यह प्रोटोकॉल कुशलता से महाधमनी फसल के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करता है और प्रस्तावित प्रसंस्करण महाधमनी जड़, महाधमनी मेहराब, और ब्रैकियोसेफेलिक धमनी में घाव परिमाणीकरण सहित बहु-उद्देश्य उपयोग के लिए महाधमनी तैयार करता है। उम्मीद है कि प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं, परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए, और निष्कर्ष है कि atherosclerosis के खिलाफ नए उपचार के लिए मार्ग प्रशस्त होगा करने के लिए नेतृत्व.
The authors have nothing to disclose.
हम पिछले चौथाई सदी में इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में मदद की है कि जीरन के हंससन के प्रयोगात्मक हृदय अनुसंधान इकाई के सभी पिछले सदस्यों को धन्यवाद. हम Antonino Nicoletti, Xinghua झोउ, अन्ना-Karin Robertson, और Inger Bodin द्वारा योगदान के लिए विशेष रूप से आभारी हैं. यह काम परियोजना अनुदान 06816 और Linnaeus समर्थन 349-2007-8703 स्वीडिश अनुसंधान परिषद से द्वारा समर्थित किया गया था, और स्वीडिश हार्ट-लंग फाउंडेशन, स्टॉकहोम काउंटी परिषद, प्रोफेसर नाना Svartz फाउंडेशन, लू और हंस Osterman से अनुदान द्वारा चिकित्सा अनुसंधान के लिए फाउंडेशन, Karolinska Institute’s रिसर्च फाउंडेशन और कारोलिंस्का संस्थान में जराचिकित्सा रोगों के लिए फाउंडेशन.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |