Murine modeller af åreforkalkning er nyttige værktøjer til at undersøge patogene veje på et Molekylær niveau, men kræver standardiseret kvantificering af læsion udvikling. Denne protokol beskriver en optimeret metode til at bestemme læsion størrelse i de store arteriel beholdere, herunder aorta roden, aortabuen, og brachiocephalic arterie.
Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden. Den underliggende årsag i de fleste tilfælde er åreforkalkning, som er delvis en kronisk inflammatorisk sygdom. Eksperimentelle åreforkalkning undersøgelser har belyst rollen af kolesterol og inflammation i sygdomsprocessen. Dette har ført til vellykkede kliniske forsøg med farmaceutiske agenter, der reducerer kliniske manifestationer af åreforkalkning. Omhyggelig og velkontrollerede eksperimenter i musemodeller af sygdommen kunne yderligere belyse patogenesen af sygdommen, som ikke er fuldt forstået. Standardiseret læsions analyse er vigtig for at reducere eksperimentel variabilitet og øge reproducerbarhed. Bestemmelse af læsion størrelse i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie er fælles endepunkter i eksperimentel åreforkalkning. Denne protokol giver en teknisk beskrivelse til vurdering af åreforkalkning på alle disse steder i en enkelt mus. Protokollen er særlig nyttig, når der er tale om begrænset materiale, hvilket ofte er tilfældet, når genetisk modificerede dyr er karakteriseret.
Hjerte-kar-sygdom er den vigtigste dødsårsag i verden med iskæmisk hjertesygdomme og slagtilfælde tegner sig for en ud af fire dødsfald1. De fleste tilfælde er forårsaget af åreforkalkning, en sygdom karakteriseret ved en langsom ophobning af lipid-lastet plaques med tegn på kronisk inflammation i store og mellemstore arterier2. Sygdommen normalt forbliver ubemærket over flere årtier, indtil en ruptur eller erosion af plaque fremkalder en arteriel trombose, der fører til iskæmisk vævsskade.
En normal arterie består af et intima lag med endotelceller og tyndt fordelte glatte muskelceller, et medielag med glatte muskelceller og elastik lamel, og et omgivende utilsigtet lag med løst bindevæv3. En intima fastholdelse af LDL forskydninger åreforkalkning udvikling4. Ophobning og modifikation af lipoproteiner fører til aggregering og fastklemning inden for arteriel intima5. En inflammatorisk respons er fremkaldt af de fangede og modificerede lipoproteiner6. Endotelceller begynder at udtrykke vedhæftnings molekyler, såsom VCAM-1 på steder i arteriel træet med turbulent blodgennemstrømning, hvilket fører til rekruttering af cirkulerende monocytter og andre leukocytter7. De infiltrerende monocytter skelner i makrofager, der opsluge lipid med efterfølgende omdannelse til makrofag skum celler8.
Atherosclerose er blevet undersøgt i musemodeller med stigende hyppighed siden midten af 1980 ‘ erne. C57BL/6 er den mest almindeligt anvendte indavlede musestamme for disse undersøgelser, og det bruges som den genetiske baggrund for de fleste genetisk modificerede stammer9. Denne stamme blev etableret i 1920 ‘ er10, og dens genom blev offentliggjort i 200211. Eksperimenter i musemodeller har flere fordele: kolonierne gengiver hurtigt, huset er pladsbesparende, og indavl reducerer eksperimentel variabilitet. Modellen giver også mulighed for genetiske manipulationer, såsom målrettede gensletninger og indsættelse af transgener. Dette har ført til ny patofysiologisk forståelse af sygdommen og nye terapi mål12.
Wild-type C57BL/6 mus er naturligt resistente over for åreforkalkning. De har de fleste af de cirkulerende kolesterol i HDL, og komplekse aterosklerotiske læsioner dannes ikke selv når fodret en højt fedtindhold og højt kolesteroltal kost13. Hyperkolesterolemic mus, såsom ApoE-/- på C57BL/6-baggrund, anvendes derfor som eksperimentelle modeller af åreforkalkning14,15. Manglen på ApoE hæmmer hepatisk optagelse af rest lipoproteiner og alvorligt foruroliger lipid metabolisme. I ApoE-/- mus er cirkulerende kolesterol overvejende i VLDL-partikler, og musene udvikler komplekse aterosklerotiske plaques på en almindelig Chow diæt.
Ldlr-/- mus efterligner udviklingen af aterosklerose set hos mennesker med familiær hyperkolesterolæmi16. Ldlr-/- mus har brug for en vestlig type kost for at udvikle åreforkalkning17. Vestlig kost efterligner menneskelig fødeindtagelse og indeholder normalt 0,15% kolesterol. LDL-receptoren genkender ApoB100 og ApoE og medierer optagelsen af LDL-partikler gennem endokytose. LDL-receptorer er grundlæggende for lever clearance af LDL fra cirkulation, mens LDL-receptor ekspression i hæmatopoietiske celler ikke påvirker denne proces. Dette åbner mulighed for knoglemarvstransplantation af ldlr+/+ celler til hyperkolesterolemic ldlr-/- modtagere og vurdering af åreforkalkning udvikling. Knoglemarv kimærer har almindeligvis været anvendt til at studere deltagelse af hæmatopoietiske celler i eksperimentel åreforkalkning. Men, knoglemarvstransplantation kan påvirke størrelsen og sammensætningen af aterosklerotiske plaques, gør fortolkningen af resultaterne tvetydige.
Forskellige varianter af ApoE-/- og ldlr-/- mus med yderligere genetiske ændringer er blevet udviklet til at studere specifikke processer af sygdommen18. Et eksempel er human APOB100-transgene ldlr-/- (hubl) mus, der bærer fuld længde menneske APOB100 gen19,20. Disse mus udvikler hyperkolesterolæmi og åreforkalkning på en regelmæssig Chow kost. Men, udviklingen af komplekse aterosklerotiske plaques tager mindst seks måneder og kortere eksperimentelle protokoller normalt bruge vestlig kost21. En stor brøkdel af plasma kolesterol cirkulerer i LDL-partikler, hvilket giver hubl -mus en mere menneskelig-lignende dyslipidemisk lipoprotein profil sammenlignet med ApoE-/- og ldlr-/- mus. Hubl -mus tillader også studier af human apob som Auto antigen22.
Musens modeller af åreforkalkning udvikle komplekse aterosklerotiske plaques med fælles træk ved sygdomme hos mennesker. Men, plaques er temmelig modstandsdygtige over for ruptur med efterfølgende myokardieinfarkt. Aterotrombose er kun sporadisk detekteres og eksperimentelt udfordrende at vurdere23,24,25. Der er udviklet særlige modeller for plaque ruptur, men forsøgsområdet mangler en pålidelig og reproducerbar model til vurdering af plaque-stabiliserende stoffer.
Kvantificering af åreforkalkning er blevet rapporteret på mange måder i litteraturen. De seneste bestræbelser har forsøgt at standardisere eksperimentel design, udførelse og rapportering af dyreforsøg26. Efterforskere har forskellige præferencer og teknikker tilpasset deres laboratorier. De fleste forskningsprojekter er også unikke på en måde, at de kræver nogle protokol ændringer. På grund af sygdommens multifaktorielle karakter varierer de optimale Kontroller mellem projekterne. Lokale forhold og manglende standardisering kan forårsage observerede forskelle i sygdomsudvikling, hvilket hæmmer fremskridtene på forskningsområdet. Forskelle i eksperimentel variation betyder også, at beregninger af statistisk effekt skal baseres på pilotundersøgelser under lokale forhold.
Kvantificering af åreforkalkning anbefales på flere steder i det vaskulære træ. Denne protokol beskriver, hvordan man kan opnå resultater fra aorta roden, aorta Arch, og brachiocephalic arterie i en enkelt mus, ud over at forlade resten af thoracoabdominal aorta for andre analyser. En ansigts præparater giver mulighed for hurtig kvantificering af lipid-ladede plaques i aortabuen. Sygdomsbyrden i brachiocephalic arterien kan også kvantificeres, hvis prøverne er omhyggeligt vist. Jo mere tidskrævende Cross-skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for detaljeret vurdering af plaque sammensætning.
Hjerte-kar-sygdom er den største morder i verden og nye forebyggende målinger er nødvendige2. Musemodeller af sygdommen giver en omfattende platform for undersøgelse af Patofysiologi og eksperimentelle behandlinger13. Pålidelig læsion størrelse kvantificering er afgørende for denne tilgang. Kvantificerings metoderne varierer dog mellem laboratorierne. Standardisering og optimering har været en løbende proces siden 1980 ‘ er13,27,33,34. Aorta rødder er dukket op som den mest populære sted at kvantificere eksperimentel åreforkalkning. Tværsnit af plaques muliggør sammenligning af plaque volumen mellem grupperne. En ansigt præparater er begunstiget for læsion kvantificering i større segmenter af aorta. En Face metode visualiserer plaque mængde og muliggør kvantificering af plaque områdedækning, men ikke tager plaque tykkelse i betragtning. Den biologiske relevans for observerede forskelle underbygges af sammenhængende resultater på forskellige steder i det vaskulære træ. Evaluering af åreforkalkning udvikling på forskellige steder adresser mulige site specifikke effekter. Effekten af transplanterede hæmatopoietiske celler på åreforkalkning udvikling kan vurderes i hyperkolesterolemic ldlr-/- chimeras. Men, hele kroppen bestråling påvirker åreforkalkning proces med site specifikke effekter. Mere fremtrædende aterosklerotiske læsioner er udviklet i aorta roden, mens reduceret læsion udvikling observeres i aorta buer35.
Vigtigere, ikke kun læsion størrelse skal behandles i undersøgelser af eksperimentel åreforkalkning. Lesion sammensætning er også en nøgleparameter. Flere plaque funktioner har været forbundet med manifestationer af sygdommen hos mennesker36. Seriel skæring af aorta roden efterlader flere sektioner til rådighed for omhyggelig analyse af plaque sammensætning. Plaque ruptur i mennesker er karakteriseret ved en tynd fibrøs hætte med få glatte muskelceller, sparsom kollagen indhold og tegn på betændelse i plaques36. Selvom plaque ruptur er en sjælden begivenhed i musemodeller af åreforkalkning, markører for plaque stabilitet er informative at evaluere. Translationelle tilgange kan bekræfte mekanistiske fund fra musemodeller og afdække vigtige træk ved sygdomme hos mennesker31. Inflammatorisk status af atherosclerotiske plaques kunne bestemmes ved at immun histokemi farvning af VCAM-1, MHC klasse II, makrofager, og lymfocytter30. Nogle protokoller bruger langsgående sektioner i den koronale plan af aortabuen eller brachiocephalic arterien til måling af aterosklerotisk læsion størrelse og sammensætning37. Men, denne alternative metode efterlader kun få sektioner, der skal analyseres, som begrænser sine applikationer.
Et første kritisk skridt i denne protokol er evnen til at høste Aortas effektivt. Hånd-øje koordination under mikroskop kræver praksis og er afgørende både for mikrodissektion og den efterfølgende fastgørelse af aortabuen. Det næste kritiske trin i denne protokol er samlingen af serielle sektioner fra aorta roden. 80 på hinanden følgende sektioner skal indsamles for hver mus, hvilket kræver både fokus og tålmodighed. Metodologiske færdigheder kunne fremskynde de beskrevne processer betragteligt. Ikke desto mindre, aterosklerotisk læsion kvantificering er stadig en tidskrævende opgave. Ny teknologi, automatiseret håndtering, og små dyr billeddannelse kan lette kvantificering af eksperimentel åreforkalkning i fremtiden. Progression af åreforkalkning er langsom og de fleste eksperimentelle protokoller i musemodeller tager mere end fire måneder at fuldføre13. Derfor, Aortas skal indsamles på en optimeret måde på undersøgelsens endepunkter. Denne protokol giver en omfattende guide til høst Aortas effektivt og den foreslåede behandling forbereder Aortas til multi-purpose brug, herunder læsion kvantificering i aorta rod, aortabuen, og brachiocephalic arterie. Forhåbentlig protokollen kan reducere eksperimentel variation, øge pålideligheden af resultater, og føre til resultater, der vil bane vejen for nye behandlinger mod åreforkalkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle tidligere medlemmer af Göran K Hanssons eksperimentelle kardiovaskulære forskningsenhed, som hjalp med at udvikle denne protokol i løbet af det sidste kvart århundrede. Vi er især taknemmelige for bidragene fra Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson og Inger Bodin. Dette arbejde blev støttet af Project Grant 06816 og Linnaeus support 349-2007-8703 fra det svenske Forskningsråd og af tilskud fra den svenske hjerte-lunge fond, Stockholms Amts råd, professor Nanna Svartz Foundation, Loo og hans Osterman Institut for medicinsk forskning, Karolinska Institutet Research Foundation og Foundation for geriatriske sygdomme i Karolinska Institutet.
Acetone | VWR Chemicals | 20066.296 | For fixation of sections for immunohistochemistry. |
Black electrical insulation tape (50 mm wide) | Any specialized retailer | – | To create pinning beds for aortic arches. |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C | Benchtop microcentrifuge. |
Cork board | Any specialized retailer | – | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm HM 560 | For serial cryosectioning of aortic roots. |
Deionized water | – | – | For rinsing and preparation of solutions. |
Digital camera | Leica Microsystems | DC480 | 5.1 megapixel CCD for high-resolution images of aortic arches and aortic root sections. |
Dissecting scissors (10 cm, straight) | World Precision Instruments | 14393 | For general dissection of organs. |
Dumont forceps #5 (11 cm, straight) | World Precision Instruments | 500341 | For microdissection of aorta. |
Ethanol 70% (v/v) | VWR Chemicals | 83801.290 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Ethanol absolute ≥99.8% | VWR Chemicals | 20821.310 | Highly flammable liquid and vapour, store in a well-ventilated place, and keep cool. |
Formaldehyde 4% stabilised, buffered (pH 7.0) | VWR Chemicals | 9713.1000 | Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
ImageJ | NIH | – | Image analysis software. |
Iris forceps (10 cm, curved, serrated) | World Precision Instruments | 15915-G | Used as anatomical forceps. |
Isopropanol | Merck | 1096341011 | Flammable liquid, causes serious eye irritation, and may cause drowsiness or dizziness. |
Kaiser's glycerol gelatine | Merck | 1092420100 | Aqueous mounting medium containing phenol. Suspected of causing genetic defects. |
Light microscope | Leica Microsystems | DM LB2 | For analysis during sectioning and documentation of Oil Red O stained micrographs. |
Mayer's hematoxylin | Histolab | 1820 | Non-toxic staining solution without chloral hydrate, but causes serious eye irritation. |
Mayo scissors (17 cm, straight) | World Precision Instruments | 501751-G | For general dissection. |
Micro Castroviejo needle holder (9 cm, straight) | World Precision Instruments | 503376 | For pinning of aortic arches. |
Microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-C | Polypropylene microtubes with snaplock cap. |
Microlance 3 needles, 23 gauge | BD | 300800 | For blood collection. |
Microlance 3 needles, 27 gauge | BD | 302200 | For perfusion of mice. |
Microvette 500 µL, K3 EDTA | Sarstedt | 20.1341.100 | For blood collection. |
Microvette 500 µL, Lithium Heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | For blood collection. |
Minutien insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | For pinning of aortic arches. |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Optimum cutting temperature (OCT) cryomount | Histolab | 45830 | For embedding tissue. |
Parafilm M | Bemis | PM992 | Paraffin wax film used to create pinning beds for aortic arches. |
Petri dishes (100×20 mm) | Any cell culture supplier | – | Proposed as a storage container for pinned aortas. |
Phosphate buffered saline (PBS) | – | – | Sterile and RNase-free solution is required for perfusion of mice. |
Qualitative filter paper (grade 1001) | Munktell | 120006 | For filtering Oil Red O working solution (typical retention 2-3 µm). |
RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76106 | For stabilization of RNA in tissue samples |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | A surface decontamination solution that destroys RNases on contact. |
Scalpel handle #3 (13 cm) | World Precision Instruments | 500236 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Standard scalpel blade #10 | World Precision Instruments | 500239 | For cutting hearts in the preparation to cryomount aortic roots. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ6 | For dissection and en face documentation |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261 | Not classified as a hazardous substance or mixture. |
Superfrost Plus microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | To collect aortic root sections. |
Tissue forceps (15 cm) | World Precision Instruments | 501741-G | For general dissection. |
Tissue-Tek cryomolds (10x10x5 mm) | Sakura | 4565 | For embedding aortic roots in OCT. |
Vannas scissors (8 cm, straight) | World Precision Instruments | 503378 | For microdissection of aorta. |