Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

CRISPR-Cas, сокращение от кластерных регулярно межпространственных коротких палиндромных повторов и связанных с CRISPR нуклеаза, состоит из одного белка nuclease (например, Cas9) в комплексе с синтетической направляющей РНК (sgRNA). Этот комплекс рибонуклеопротеинов нацелен на фермент Cas9, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК при специфическом геномном локусе^1. Двухцепочечные перерывы могут быть отремонтированы с помощью гомологии направленного ремонта (HDR) или, чаще всего, через негомологическую конечную присоединение (NHEJ), механизм ремонта, подверженный ошибкам, который приводит к вставке и/или удалению (INDELS), которые часто нарушают функцию гена ¹. Эффективность и простота CRISPR позволяет ранее недостижимый уровень геномного таргетинга, что намного превосходит предыдущие технологии редактирования генома, т.е. цинковый палец nucleases (ЗНФ) или транскрипции активатор-как эффектор nucleases ( TALENS), оба из которых страдают от повышенной сложности конструкции, более низкой эффективности трансфекции, и ограничения в мультиплексном редактировании^{генов 2}.

Основное исследовательское применение однонаправного редактирования генома на основе РНК позволило ученым эффективно и недорого изучить функции отдельных генов и топологию генетических сетей взаимодействия. Способность выполнять функциональные экраны генома была значительно расширена с помощью системы CRISPR-Cas, особенно по сравнению с более ранними генетическими технологиями возмущения, такими как РНК-интерференция (РНК) и мутагенез генной ловушки. В частности, RNAi страдает от высоких вне цели эффекты и неполный нокдаун, в результате чего более низкая чувствительность и специфичность по сравнению с CRISPR^3,4,5, в то время как методы генной ловушки являются возможными только в гаплоидных ячейки для экранов потери функций, ограничивающих область клеточных моделей, которые могут быть допрошены⁶. Способность CRISPR генерировать полный выбив из генов обеспечивает более биологически надежную систему для допроса мутантных фенотипов, с низким уровнем шума, минимальными эффектами вне цели и последовательной активностью реагентов^5. CRISPR-Cas9 sgRNA библиотеки, которые ориентированы на весь геном человека в настоящее время широко доступны, что позволяет одновременное поколение тысяч генов нокаутов в одном эксперименте^3,7,8,9 .

Мы разработали уникальные библиотеки scgRNA по всей геному CRISPR-Cas9, называемые библиотеками Toronto Knock-out (TKO) (доступны через Addgene), которые компактны и оптимизированы последовательность для облегчения функционального геномики высокого разрешения экранов. Последняя библиотека, TKOv3, ориентирована на 18 000 человеческих генов кодирования белка с 71 090 направляющих, оптимизированных для редактирования эффективности с использованием эмпирических данных¹⁰. Кроме того, TKOv3 доступен в качестве однокомпонентной библиотеки (LCV2:::TKOv3, Addgene ID #90294), выражающей Cas9 и sgRNA на одном векторе, облегчая необходимость создания стабильных клеток Cas9- Expressing, что позволяет нокаутировать геном по широкому кругу типы клеток млекопитающих. TKOv3 также доступен в векторе без Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) и может быть использован в ячейках, которые выражают Cas9¹¹.

Геном всей CRISPR-Cas9 редактируемых клеток населения может подвергаться различным условиям роста, с обилием sgRNAs с течением времени количественно следующего поколения секвенирования, обеспечивая считывание для оценки отсева или обогащения клеток с прослеживаемыми генетическими Возмущений. Библиотеки выбивания CRISPR могут быть использованы для определения генов, которые, после возмущения, вызывают дефекты клеточного фитнеса, умеренную чувствительность к лекарственным препаратам (например, чувствительные или устойчивые гены), регулировать экспрессию белка (например, репортер) или необходимы для определенного функции пути и клеточного состояния^12,13,14. Например, дифференциальные фитнес-экраны в линии раковых клеток могут выявить как истощение, так и уменьшение онкогенов и обогащения или увеличение генов супрессоров опухолей^3,14,15. Аналогичным образом, использование промежуточных доз терапевтических препаратов может выявить как лекарственной устойчивости и сенсибилизации генов^16,17.

Приведенный здесь подробный протокол скрининга для генома масштаба CRISPR-Cas9 потери функции скрининга с использованием Торонто Knock-out библиотек (TKOv1 или v3) в клетках млекопитающих от библиотеки поколения, скрининг производительности для анализа данных. Хотя этот протокол был оптимизирован для скрининга с использованием библиотек Toronto Knock-out, он может быть применен и масштабируемым для всех объединенных библиотек CRISPR sgRNA.