Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen
Summary
Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.
Abstract
Genoom bewerking met het crispr-CAS-systeem heeft de mogelijkheid om de genomen van verschillende organismen nauwkeurig te bewerken enorm uitgebreid. In de context van zoogdiercellen vertegenwoordigt deze technologie een nieuw middel om Genome-brede genetische schermen voor functionele genomics-onderzoeken uit te voeren. Bibliotheken van Guide RNAs (sgRNA) gericht op alle open Lees frames toestaan de facile generatie van duizenden genetische verstoringen in een enkele pool van cellen die kunnen worden gescreend voor specifieke fenotypes om de genfunctie en cellulaire processen in een zonder vooringenomen en systematische wijze. CRISPR-CAS schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de genetische blauwdrukken voor cellulaire fenotypes te achterhalen. Bovendien kan differentiële analyse van schermen uitgevoerd in verschillende cellijnen en van verschillende kankersoorten genen identificeren die contextueel essentieel zijn in tumorcellen, waardoor potentiële doelen voor specifieke therapieën tegen kanker worden onthuld. Het uitvoeren van genoom-brede schermen in menselijke cellen kan ontmoedigend zijn, omdat dit de behandeling van tientallen miljoenen cellen inhoudt en een analyse van grote gegevenssets vereist. De details van deze schermen, zoals de karakterisering van de cellijn, overwegingen van CRISPR Library en het begrijpen van de beperkingen en mogelijkheden van CRISPR-technologie tijdens de analyse, worden vaak over het hoofd gezien. Hier is een gedetailleerd protocol voor de succesvolle prestaties van gegroepeerde genoom-Wide CRISPR Cas9 gebaseerde schermen.
Introduction
CRISPR-CAS, kort voor geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen en CRISPR-geassocieerde nuclease, bestaat uit een enkelvoudig Nuclease eiwit (bijv. Cas9) in complex met een synthetische gids RNA (sgRNA). Dit RiboNucleoProteïne complex richt zich op het Cas9 enzym om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te induceren bij een specifieke genomische Locus1. Dubbel-gestrande pauzes kunnen worden gerepareerd via homologie gerichte reparatie (HDR) of, meer in het algemeen, door niet-homologeuze end-aansluiting (NHEJ), een foutgevoelig reparatie mechanisme dat resulteert in inbrengen en/of verwijderingen (INDELS) die vaak de genfunctie verstoren 1. de efficiëntie en eenvoud van crispr maakt een eerder onbereikbaar niveau van genomische targeting mogelijk dat ver overtreft eerdere genoom bewerkings technologieën [d.w.z. zink vinger nucleasen (znf) of transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen ( TALENS), die beide lijden aan een verhoogde ontwerp complexiteit, lagere transfectie-efficiëntie en beperkingen in multiplex Gene Editing2].
De basis onderzoekstoepassing van CRISPR single-Guide RNA-gebaseerde genoom Editing heeft wetenschappers toegestaan om de functies van individuele genen en de topologie van genetische interactie netwerken efficiënt en voordelig te ondervragen. De mogelijkheid om functionele genoom-brede schermen uit te voeren is sterk verbeterd door het gebruik van het CRISPR-CAS systeem, vooral in vergelijking met eerdere genetische perturbatie technologieën zoals RNA interferentie (RNAi) en Genval mutagenese. In het bijzonder lijdt RNAi aan hoge doel effecten en onvolledige knockdown, wat resulteert in een lagere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met crispr3,4,5, terwijl gentrap methoden alleen haalbaar zijn in haploïde cellen voor verlies-van-functie schermen, beperking van het bereik van celmodellen die kunnen worden verhoord6. Het vermogen van CRISPR om volledige genknock-out te genereren biedt een meer biologisch robuust systeem om Mutante fenotypes te ondervragen, met weinig ruis, minimale off-target effecten en consistente activiteit over reagentia5. Crispr Cas9 sgrna-bibliotheken die het hele menselijke genoom targeten, zijn nu algemeen beschikbaar, waardoor gelijktijdige opwekking van duizenden genknock-outs in een enkel experiment3,7,8,9 .
We hebben unieke CRISPR-Cas9 Genome-wide sgRNA lentivirale bibliotheken ontwikkeld, de Toronto knock-out (TKO) bibliotheken (beschikbaar via Addgene) die compact en sequence-geoptimaliseerd zijn om functionele genomics schermen met hoge resolutie te faciliteren. De nieuwste bibliotheek, TKOv3, richt zich op ~ 18.000 humane eiwit codering genen met 71.090 gidsen geoptimaliseerd voor het bewerken van efficiëntie met empirische data10. Daarnaast is TKOv3 beschikbaar als een bibliotheek met één component (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) die Cas9 en sgRNAs uitdrukken op een enkele vector, waardoor de noodzaak voor het genereren van stabiele Cas9-uitstellende cellen wordt verlicht, zodat het genoom-brede knock-out over een breed scala aan celtypen van zoogdieren. TKOv3 is ook beschikbaar in een vector zonder Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) en kan worden gebruikt in cellen die Cas911uitdrukken.
Een genoom-brede CRISPR Cas9 bewerkte celpopulatie kan worden blootgesteld aan verschillende groeiomstandigheden, waarbij de overvloed aan Sgrna’s in de tijd wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing, waardoor een uitlezen wordt gegeven om de drop-out of verrijking van cellen te beoordelen met traceerbare genetische Verstoringen. CRISPR knock-out bibliotheken kunnen worden aangewend om genen te identificeren die, na perturbatie, cellulaire fitness defecten veroorzaken, matige geneesmiddel gevoeligheid (bijv. gevoelige of resistente genen), eiwit expressie reguleren (bijv., reporter), of zijn vereist voor een bepaalde Pathway functie en cellulaire toestand12,13,14. Differentiële fitness schermen in een kankercel lijn kunnen bijvoorbeeld zowel de uitputting als de reductie van oncogenen en verrijking of een toename van de tumor suppressors genen3,14,15identificeren. Evenzo kan het gebruik van tussenliggende doses therapeutische geneesmiddelen zowel de resistentie van de drug en sensibilisatie genen16,17onthullen.
Hier is een gedetailleerd screening protocol voor CRISPR-Cas9 verlies-van-functie screening met behulp van de Toronto knock-out libraries (TKOv1 of v3) in zoogdiercellen van bibliotheek generatie, screening van prestaties tot gegevensanalyse. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor screening met behulp van de Toronto knock-out Bibliotheken, het kan worden toegepast en schaalbaar te worden tot alle CRISPR sgRNA gepoolde bibliotheken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de eenvoud van gebruik en hoge buigbaarheid, is CRISPR-technologie op grote schaal goedgekeurd als het instrument van keuze voor precieze genoom bewerking. Gepoolde CRISPR-screening biedt een methode om duizenden genetische verstoringen te ondervragen in één experiment. In gepoolde schermen dienen sgRNA-bibliotheken als moleculaire barcodes, omdat elke sequentie uniek is en wordt toegewezen aan het beoogde gen. Door het genomisch DNA van de celpopulatie te isoleren, kunnen genen die het fenotype van belang vero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Genome Canada, het Ontario Research Fund en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
