Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

CRISPR-CAS, abreviação de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente e nuclease associada a CRISPR, consiste em uma única proteína nuclease (por exemplo, Cas9) em complexo com um RNA guia sintético (sgRNA). Este complexo de ribonucleoproteína tem como alvo a enzima Cas9 para induzir quebras de DNA de dupla cadeia em um locus genómico específico¹. As rupturas dobro-encalhado podem ser reparadas através da reparação dirigida homologia (HDR) ou, mais geralmente, com a junção não-homóloga da extremidade (nhej), um mecanismo de reparo propenso ao erro que resulte na inserção e/ou nos deleções (indels) que interrompem freqüentemente a função do gene a eficiência ¹. The e a simplicidade de crispr permitem um nível previamente inatingível da segmentação genomic que ultrapassa distante tecnologias precedentes da edição do genoma [isto é, nucleases do dedo do zinco (ZNF) ou a transcrição ativador-como nucleases do efetoras ( TALENS), ambos sofrem de complexidade de design aumentada, menor eficiência de transfecção e limitações na edição de genes multiplex²].

A aplicação básica da pesquisa da edição do genoma RNA-baseada do único-guia de CRISPR permitiu que os cientistas interrogue eficientemente e barata as funções de genes individuais e topologia de redes genéticas da interação. A habilidade de executar telas funcionais do genoma-largo foi aumentada extremamente pelo uso do sistema de crispr-CAS, particular quando comparado às tecnologias genéticas mais adiantadas do perturbação tais como a interferência do RNA (RNAi) e a mutagenese da armadilha do gene. Em particular, RNAi sofre de efeitos off-Target elevados e knockdown incompleto, resultando em menor sensibilidade e especificidade em comparação com crispr^3,4,5, enquanto os métodos de armadilha genética só são viáveis em haplóides células para telas de perda de função, limitando o escopo de modelos de células que podem ser interrogados⁶. A capacidade de CRISPR para gerar o knock-out completo do gene fornece um sistema mais biologicamente robusto para interrogar fenótipos mutantes, com baixo ruído, efeitos mínimos fora do alvo e atividade consistente em todos os reagentes⁵. As bibliotecas de crispr-Cas9 sgrna que visam todo o genoma humano estão agora amplamente disponíveis, permitindo a geração simultânea de milhares de knock-outs de genesem um único experimento^3,7,8,9 .

Desenvolvemos bibliotecas de lentivirais sgRNA em todo o genoma CRISPR-Cas9, denominadas bibliotecas de Toronto knock-out (TKO) (disponíveis através do Addgene) que são compactas e otimizadas para sequências para facilitar telas de genômica funcional de alta resolução. A mais recente biblioteca, TKOv3, alvos ~ 18.000 genes de codificação de proteínas humanas com 71.090 guias otimizados para a eficiência de edição usando dados empíricos¹⁰. Além disso, TKOv3 está disponível como uma biblioteca de um componente (LCV2:: TKOv3, ID de Addgene #90294) expressando Cas9 e sgRNAs em um único vetor, aliviando a necessidade de gerar células de expressão de Cas9 estáveis, permitindo knock-out em todo o genoma em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 também está disponível em um vetor sem Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) e pode ser utilizado em células que expressam Cas9¹¹.

Uma população de células editada em todo o genoma CRISPR-Cas9 pode ser exposta a diferentes condições de crescimento, com a abundância de sgRNAs ao longo do tempo quantificada por sequenciamento de próxima geração, proporcionando uma leitura para avaliar o abandono ou enriquecimento de células com genética rastreável Perturbações. As bibliotecas de knock-out CRISPR podem ser aproveitadas para identificar genes que, após a perturbação, causam defeitos de aptidão celular, sensibilidade moderada à droga (por exemplo, genes sensíveis ou resistentes), regulam a expressão protéica (por exemplo, repórter), ou são necessários para um certo função do caminho e estado celular^12,13,14. Por exemplo, as telas diferenciais de aptidão em uma linha celular cancerosa podem identificar tanto depleção ou redução de oncogenes e enriquecimento ou um aumento dos genes supressores de tumor^3,14,15. Da mesma forma, o uso de doses intermediárias de fármacos terapêuticos pode revelar^{genes de resistência}e sensibilização dos fármacos^16,17.

Aqui é fornecido um protocolo detalhado de triagem para a triagem de perda de função de CRISPR-Cas9 em escala de genoma usando as bibliotecas de Toronto knock-out (TKOv1 ou V3) em células de mamíferos de geração de biblioteca, desempenho de triagem para análise de dados. Embora esse protocolo tenha sido otimizado para triagem usando as bibliotecas de knock-out de Toronto, ele pode ser aplicado e tornar-se escalável para todas as bibliotecas agrupadas do sgRNA CRISPR.