Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

CRISPR-Cas, abbreviazione per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e nuclease associate a CRISPR, è costituito da una singola proteina nucleasi (ad esempio Cas9) in complesso con una guida sintetica RNA (sgRNA). Questo complesso di ribonucleoproteina si rivolge all’enzima Cas9 per indurre rotture di DNA a doppio filamento in uno specifico locus genomico¹. Le rotture a doppio filamento possono essere riparate tramite riparazione diretta homologia (HDR) o, più comunemente, attraverso l’unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo di riparazione soggetto a errori che si traduce in inserimento e/o delezioni (INDELS) che spesso interrompono la funzione genica ¹. L’efficienza e la semplicità di CRISPR consentono un livello di target genomico precedentemente irraggiungibile che supera di gran lunga le precedenti tecnologie di editing del genoma [ad esempio, nucleasi di dita di zinco o trascrittiviere nuosi effettore simili a TALENS), entrambi affetti da una maggiore complessità progettuale, da una minore efficienza di trasfezione e da limitazioni nell’editing genico multiplex²].

L’applicazione di ricerca di base dell’editing del genoma basato sull’RNA CRISPR ha permesso agli scienziati di interrogare in modo efficiente ed economico le funzioni dei singoli geni e la topologia delle reti di interazione genetica. La capacità di eseguire schermi funzionali ad ampio raggio su genoma è stata notevolmente migliorata dall’uso del sistema CRISPR-Cas, in particolare se confrontato con le precedenti tecnologie di perturbazione genetica come l’interferenza dell’RNA (RNAi) e la mutagenesi della trappola genica. In particolare, l’RNAi soffre di elevati effetti fuori bersaglio e knockdown incompleto, con conseguente minore sensibilità e specificità rispetto al CRISPR^3,4,5, mentre i metodi di trappola genica sono fattibili solo in aploide celle per le schermate di perdita della funzione, limitando l’ambito dei modelli cellulari che possono essere interrogati⁶. La capacità di CRISPR di generare un sistema completo di eliminazione genica fornisce un sistema più biologicamente robusto per interrogare i fenotipi mutanti, con basso rumore, effetti minimi fuori bersaglio e un’attività costante tra i reagenti⁵. Le librerie di sgRNA CRISPR-Cas9 che si rivolgono all’intero genoma umano sono ora ampiamente disponibili, consentendo la generazione simultanea di migliaia di eliminazioni geniche in un singolo esperimento^3,7,8,9 .

Abbiamo sviluppato uniche librerie di lentivirali sgRNAvirale a livello genomico CRISPR-Cas9 chiamate le librerie di Toronto Knock-out (TKO) (disponibili tramite Addgene) compatte e ottimizzate per la sequenza per facilitare schermi genomici funzionali ad alta risoluzione. L’ultima libreria, TKOv3, si rivolge a 18.000 geni di codifica delle proteine umane con 71.090 guide ottimizzate per l’editing dell’efficienza utilizzando dati empirici¹⁰. Inoltre, TKOv3 è disponibile come libreria a un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) che esprime Cas9 e sgRNA su un singolo vettore, alleviando la necessità di generare celle stabili e che esprimono Cas9, consentendo l’eliminazione a livello di genoma in un’ampia gamma di tipi di cellule dei mammiferi. TKOv3 è disponibile anche in un vettore senza Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) e può essere utilizzato in celle che esprimono Cas9¹¹.

Una popolazione cellulare modificata CRISPR-Cas9 a livello di genoma può essere esposta a diverse condizioni di crescita, con l’abbondanza di sgRNA nel tempo quantificati dal sequenziamento di prossima generazione, fornendo una lettura per valutare l’abbandono o l’arricchimento delle cellule con genetica tracciabile Perturbazioni. Le librerie knock-out CRISPR possono essere sfruttate per identificare i geni che, dopo la perturbazione, causano difetti di forma fisica cellulare, sensibilità moderata ai farmaci (ad esempio, geni sensibili o resistenti), regolano l’espressione proteica (ad esempio, reporter) o sono necessari per un certo funzione del percorso e lo stato cellulare^12,13,14. Ad esempio, schermi di fitness differenziale in una linea cellulare del cancro in grado di identificare sia l’esaurimento o la riduzione di oncogeni e arricchimento o un aumento dei geni soppressori tumorali^3,14,15. Allo stesso modo, l’uso di dosi intermedie di farmaci terapeutici può rivelare sia la resistenza ai farmaci che i geni di sensibilizzazione^16,17.

Fornito qui è un protocollo di screening dettagliato per lo screening della perdita di perdita CRISPR-Cas9 su scala genomica utilizzando le librerie Knock-out di Toronto (TKOv1 o v3) nelle cellule dei mammiferi dalla generazione di librerie, dalle prestazioni di screening all’analisi dei dati. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per lo screening utilizzando le librerie Knock-out di Toronto, può essere applicato e diventare scalabile a tutte le librerie in pool di sgRNA CRISPR.