Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

CRISPR-Cas, abrégé pour les répétitions palindromic courtes régulièrement interspatiales et les nucléases associées au CRISPR, se compose d’une seule protéine nucléase (p. ex. Cas9) en complexe avec un ARN guide synthétique (sgRNA). Ce complexe de ribonucléoprotéines cible l’enzyme Cas9 pour induire des ruptures d’ADN à double brin à un locus génomique spécifique¹. Les pauses à double brin peuvent être réparées par l’intermédiaire d’une réparation dirigée par homologie (HDR) ou, plus généralement, par l’assemblage de fin non homologue (NHEJ), un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne une insertion et/ou des suppressions (INDELS) qui perturbent fréquemment la fonction génique. ¹. L’efficacité et la simplicité de CRISPR permettent un niveau de ciblage génomique jusque-là inaccessible qui dépasse de loin les technologies précédentes d’édition du génome [c.-à-d. les nucléases de doigts de zinc (ZNF) ou les nucléases effectrices de type activateur de transcription ( TALENS), qui souffrent tous deux d’une complexité de conception accrue, d’une efficacité de transfection plus faible et de limitations dans l’édition de gènes multiplex²].

L’application de recherche fondamentale de l’édition du génome à base d’ARN à guide unique CRISPR a permis aux scientifiques d’interroger efficacement et à peu de frais les fonctions des gènes individuels et la topologie des réseaux d’interaction génétique. La capacité d’effectuer des écrans fonctionnels à l’échelle du génome a été grandement améliorée par l’utilisation du système CRISPR-Cas, en particulier par rapport aux technologies de perturbation génétique antérieures telles que l’interférence de l’ARN (ARNi) et la mutagénèse piège à gènes. En particulier, l’ARNi souffre d’effets hors cible élevés et d’un renversement incomplet, ce qui entraîne une sensibilité et une spécificité plus faibles par rapport à CRISPR^3,4,5, tandis que les méthodes de piège à gènes ne sont réalisables que dans les haploïdes cellules pour les écrans de perte de fonction, limitant la portée des modèles cellulaires qui peuvent être interrogés⁶. La capacité de CRISPR à générer des éliminations génétiques complètes fournit un système plus biologiquement robuste pour interroger les phénotypes mutants, avec un faible bruit, des effets minimes hors cible et une activité constante entre les réactifs⁵. CrispR-Cas9 sgRNA bibliothèques qui ciblent l’ensemble du génome humain sont maintenant largement disponibles, permettant la génération simultanée de milliers de gènes knock-outs dans une seule expérience^3,7,8^,9 .

Nous avons mis au point des bibliothèques de lentilles sgRNA à l’échelle du génome CRISPR-Cas9 uniques appelées bibliothèques Toronto Knock-out (TKO) (disponibles par l’entremise d’Addgene) qui sont compactes et optimisées pour faciliter les écrans de génomique fonctionnelle à haute résolution. La dernière bibliothèque, TKOv3, cible 18 000 gènes de codage des protéines humaines avec 71 090 guides optimisés pour l’efficacité de l’édition à l’aide de données empiriques¹⁰. En outre, TKOv3 est disponible en tant que bibliothèque à un composant (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) exprimant Cas9 et sgRNAs sur un seul vecteur, allégeant la nécessité de générer des cellules stables exprimant Cas9, permettant à l’échelle du génome knock-out à travers un large éventail de types de cellules de mammifères. TKOv3 est également disponible dans un vecteur sans Cas9 (pLCKO2:TKOv3, Addgene ID 125517) et peut être utilisé dans les cellules qui expriment Cas9¹¹.

Une population cellulaire éditée par LE CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome peut être exposée à différentes conditions de croissance, l’abondance de sgARN au fil du temps étant quantifiée par le séquençage de la prochaine génération, fournissant une lecture pour évaluer le décrochage ou l’enrichissement des cellules ayant une génétique traçable perturbations. Les bibliothèques KNOCK-out CRISPR peuvent être exploitées pour identifier les gènes qui, lors d’une perturbation, causent des défauts de forme physique cellulaire, une sensibilité modérée aux médicaments (p. ex., des gènes sensibles ou résistants), régulent l’expression des protéines (p. ex., journaliste) ou sont nécessaires pour un certain fonction de voie et état cellulaire^12,13,14. Par exemple, les écrans différentiels de forme physique dans une ligne de cellules cancéreuses peuvent identifier l’épuisement ou la réduction des oncogènes et de l’enrichissement ou une augmentation des gènes de suppresseurs de tumeur^3,14,15. De même, l’utilisation de doses intermédiaires de médicaments thérapeutiques peut révéler à la fois la résistance aux médicaments et les gènes de sensibilisation^16,17.

Il s’agit ici d’un protocole de dépistage détaillé pour le dépistage de la perte de fonction CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome à l’aide des bibliothèques Knock-out de Toronto (TKOv1 ou v3) dans les cellules des mammifères, de la génération de bibliothèques, du rendement du dépistage à l’analyse des données. Bien que ce protocole ait été optimisé pour le dépistage à l’aide des bibliothèques Knock-out de Toronto, il peut être appliqué et devenir évolutif dans toutes les bibliothèques regroupées CRISPR sgRNA.