Summary

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Published: September 04, 2019
doi:

Summary

توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.

Abstract

وقد أدى تحرير الجينوم باستخدام نظام كريسبر-كاس إلى تقدم كبير في القدرة على تحرير الجينومات من مختلف الكائنات الحية بدقة. وفي سياق خلايا الثدييات، تمثل هذه التكنولوجيا وسيلة جديدة لإجراء شاشات جينية على نطاق الجينوم من أجل دراسات علم الجينوم الوظيفية. تسمح مكتبات الإرشاد RNAs (sgRNA) التي تستهدف جميع إطارات القراءة المفتوحة بتوليد الآلاف من الاضطرابات الوراثية السهلة في مجموعة واحدة من الخلايا التي يمكن فحصها لأنواع ظاهرية محددة لتوريط وظيفة الجينات والعمليات الخلوية في بطريقة غير متحيزة ومنهجية. توفر شاشات CRISPR-Cas للباحثين طريقة بسيطة وفعالة وغير مكلفة للكشف عن المخططات الوراثية للأنماط الظاهرية الخلوية. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل التفاضلي للشاشات التي يتم إجراؤها في مختلف خطوط الخلايا ومن أنواع السرطان المختلفة يمكن أن يحدد الجينات الضرورية من حيث السياق في الخلايا السرطانية، مما يكشف عن الأهداف المحتملة لعلاجات محددة مضادة للسرطان. ويمكن أن يكون أداء الشاشات على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية أمراً شاقاً، لأن ذلك ينطوي على معالجة عشرات الملايين من الخلايا ويتطلب تحليلاً لمجموعات كبيرة من البيانات. غالباً ما يتم تجاهل تفاصيل هذه الشاشات، مثل توصيف خط الخلية، واعتبارات مكتبة CRISPR، وفهم حدود وقدرات تقنية CRISPR أثناء التحليل. ويرد هنا بروتوكول مفصل للأداء الناجح للشاشات المجمعة على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9.

Introduction

كريسبر-كاس، قصيرة لتتجمع بانتظام بين المسافات قصيرة باليندروميك وتكرار المرتبطة كريسبر، يتكون من بروتين nuclease واحد (على سبيل المثال، Cas9) في مجمع مع الحمض النووي الريبي دليل الاصطناعية (sgRNA). يستهدف هذا المركب الريبونوكليوبروتين إنزيم Cas9 للحث على فواصل الحمض النووي المزدوج ة في موضع جيني محدد1. يمكن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق إصلاح موجه ة (HDR) أو، بشكل أكثر شيوعًا، من خلال الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ)، وهي آلية إصلاح عرضة للخطأ تؤدي إلى الإدراج و/أو الحذف (INDELS) التي تعطل في كثير من الأحيان وظيفة الجينات 1.كفاءة وبساطة كريسبر تمكن من مستوى لا يمكن تحقيقه من قبل من استهداف الجينوم الذي يتجاوز بكثير تقنيات تحرير الجينوم السابقة [أي، الزنك الاصبع nucleases (ZNF) أو الفاعل المنشط النسخ مثل nucleases ( TALENS)، وكلاهما يعاني من تعقيد التصميم المتزايد، وانخفاض كفاءة التغوط، والقيود في تحرير الجينات متعددة2].

وقد أتاح التطبيق البحثي الأساسي لتحرير الجينوم القائم على الحمض النووي الريبي من كريسبر بكفاءة وبتكلفة زهيدة للعلماء أن يستجوبوا بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة وظائف الجينات الفردية وطبولوجيا شبكات التفاعل الجيني. وقد تعززت القدرة على أداء الشاشات الوظيفية على نطاق الجينوم إلى حد كبير باستخدام نظام كريسبر-كاس، لا سيما عند مقارنتها بتكنولوجيات الاضطراب الجيني السابقة مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وموت فخ الجينات. على وجه الخصوص، RNAi يعاني من آثار عالية خارج الهدف وضربة قاضية غير مكتملة، مما أدى إلى انخفاض الحساسية والخصوصية بالمقارنة مع كريسبرفي حين أن أساليب فخ الجينات هي ممكنة فقط في haploid خلايا لشاشات فقدان وظيفة، والحد من نطاق نماذج الخلية التي يمكن استجوابها6. قدرة كريسبر على توليد الجينات كاملة خروج المغلوب يوفر نظام أكثر قوة بيولوجيا لاستجواب الأنماط الظاهرية متحولة، مع انخفاض مستوى الضجيج، والحد الأدنى من الآثار خارج الهدف والنشاط المستمر عبر الكواشف5. تتوفر الآن على نطاق واسع مكتبات CRISPR-Cas9 sgRNA التي تستهدف الجينوم البشري بأكمله، مما يسمح بتوليد الآلاف من الضربات الذاتية للجين في تجربةواحدة3و7و8و9 .

لقد قمنا بتطوير مكتبات فريدة من نوعها على نطاق الجينوم كريسبر-Cas9 sgRNA lentiviral تسمى مكتبات تورونتو خروج المغلوب (TKO) (المتاحة من خلال Addgene) التي هي المدمجة وتسلسل الأمثل لتسهيل شاشات الجينوم وظيفية عالية الدقة. أحدث مكتبة، TKOv3، تستهدف ~ 18،000 الجينات الإنسان البروتين الترميز مع 71،090 أدلة الأمثل لكفاءة التحرير باستخدام البيانات التجريبية10. بالإضافة إلى ذلك، TKOv3 متاح كمكتبة مكون واحد (LCV2::TKOv3، معرف Addgene #90294) التعبير عن Cas9 وsgRNAs على متجه واحد، مما يخفف من الحاجة إلى توليد خلايا ثابتة التعبير عن Cas9، مما يتيح ضرب على نطاق الجينوم عبر مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثدييات. TKOv3 هو متاح أيضا في ناقلات دون Cas9 (pLCKO2::TKOv3, معرف Addgene # 125517) ويمكن استخدامها في الخلايا التي تعبر Cas911.

يمكن أن يتعرض عدد الخلايا المحررة من CRISPR-Cas9 على نطاق الجينوم لظروف نمو مختلفة، مع وفرة sgRNAs مع مرور الوقت كمياً من خلال تسلسل الجيل التالي، مما يوفر قراءة لتقييم التسرب أو إثراء الخلايا ذات الجينات الوراثية التي يمكن تتبعها الاضطرابات. يمكن تسخير مكتبات كريسبر للخروج من الباب لتحديد الجينات التي تسبب، عند الاضطراب، عيوب ًا في اللياقة البدنية الخلوية، أو حساسية معتدلة للأدوية (مثل الجينات الحساسة أو المقاومة)، أو تنظم التعبير عن البروتين (مراسل، على سبيل المثال)، أو تكون مطلوبة لمعين وظيفة المسار والدولة الخلوية12،13،14. على سبيل المثال، شاشات اللياقة البدنية التفاضلية في خط الخلايا السرطانية يمكن تحديد كلمن استنفاد أو الحد من الأنكوجينيات والإثراء أو زيادة الجينات مثبطات الورم14،15. وبالمثل، يمكن استخدام جرعات وسيطة من الأدوية العلاجية تكشف عن كل من مقاومة المخدرات وجينات التوعية16،17.

وترد هنا بروتوكول فحص مفصل لفحص فقدان الوظائف على نطاق الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام مكتبات تورونتو للخروج من الباب العام (TKOv1 أو v3) في خلايا الثدييات من توليد المكتبات، وأداء الفرز إلى تحليل البيانات. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسينه للفرز باستخدام مكتبات تورونتو خروج المغلوب، فإنه يمكن تطبيقه وتصبح قابلة للتحجيم لجميع المكتبات تجمع كريسبر sgRNA.

Protocol

وينبغي أن تتبع التجارب المبينة أدناه المبادئ التوجيهية لمكتب الصحة والسلامة البيئيين التابع للمعهد. 1. مجمعة كريسبر sgRNA مكتبة لينفيروسيت تضخيم بلازميد تمييع مكتبة الحمض النووي البلازميد البلازميد الجاهز ة كريسبر إلى 50 نانوغرام/ميكرولتر في TE (على سبيل المثال، TKOv3). <…

Representative Results

نظرة عامة على سير عمل فحص كريسبر على نطاق الجينوم يوضح الشكل 1 لمحة عامة عن تدفق أعمال فحص كريسبر المجمع، بدءاً من إصابة الخلايا المستهدفة بفيروس لينتي في مكتبة كريسبر في محطة وزارة الداخلية المنخفضة لضمان أحداث …

Discussion

نظرًا لبساطتها في الاستخدام والموثوقية العالية، فقد تم اعتماد تقنية CRISPR على نطاق واسع كأداة اختيار لتحرير الجينوم بدقة. يوفر فحص كريسبر المجمع طريقة لاستجواب الآلاف من الاضطرابات الوراثية في تجربة واحدة. في الشاشات المجمعة، تعمل مكتبات sgRNA كالباركود الجزيئي، حيث أن كل تسلسل فريد ويتم تع?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل جينوم كندا، وصندوق أونتاريو للبحوث، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Play Video

Cite This Article
Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

View Video