Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas¹. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz²; Entretanto, a microscopia recente da super-definição³ e a microscopia de elétron (em)⁴ estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específica. EM é uma técnica apropriada para alcançar um contraste suficientemente de alta resolução para estudos estruturais das conexões entre mitocôndria e ER. Entretanto, uma desvantagem é a informação limitada do eixo z porque as seções finas devem ser aproximadamente 60 nanômetro ou mais finas para a microscopia de elétron convencional da transmissão (TEM). Para uma imagem EM z-axis suficiente, a microscopia eletrônica tridimensional (3DEM) pode ser usada⁵. No entanto, isso envolve a preparação de centenas de seções seriais finas de células inteiras, o que é um trabalho muito complicado que apenas alguns tecnólogos qualificados têm dominado. Estas seções finas são coletadas em grades de um furo de um buraco com revestimento de película de formvar frágil. Se a película quebra em um Gird, a imagem latente de série e a reconstrução do volume não são possíveis. A microscopia eletrônica de varredura do bloco-cara de série (SBEM) é uma técnica popular para 3DEM que use o corte destrutivo do bloco do en dentro da câmara de vácuo do microscópio de elétron da varredura (SEM) com uma faca do diamante (Dik-SBEM) ou um feixe focalizado do íon (FIB-SEM) ⁶. no entanto, porque essas técnicas não estão disponíveis em todas as instalações, sugerimos tomografia de matriz⁷ usando corte Serial e sem. No tomography da disposição, as seções de série cortadas usando um ultramicrotome são transferidas a um lamela de vidro em vez de uma grade de tem e visualizadas através da microscopia de luz e do sem⁸. Para aumentar o sinal para a imagem latente do elétron do backscatter (BSE), nós utilizamos um en Bloc em que mancha o protocolo que emprega o tetróxido do ósmio (Oso₄)-pilhas fixas com thiocarbohydrazide osmiophilic (tch)⁹, permitindo que nós obtenhamos imagens sem coloração dupla pós-incorporação.

Adicionalmente, o marcador mitocondrial SCO1 (citocromo c oxidase assembly protein 1) – ascorbato peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ molecular tag foi usado para visualizar mitocôndria no nível de em. APEX2 é de aproximadamente 28 kDa e é derivado de ascorbato de soja peroxidase¹¹. Foi desenvolvida para mostrar a posição detalhada de proteínas específicas no nível do em da mesma maneira que a proteína proteína-etiquetada fluorescente verde é usada na microscopia de luz. APEX2 converte 3, 3 ‘-diaminobenzidina (DAB) em um polímero osmiofílico insolúvel no local da tag na presença do peróxido de hidrogênio cofator (H₂o₂). APEX2 pode ser usado como uma alternativa à rotulagem tradicional do anticorpo no em, com uma localização da proteína durante todo a profundidade da pilha inteira. Em outras palavras, a proteína APEX2-etiquetada pode ser visualizada pelo osmication específico¹¹ sem rotulagem immunogold e permeabilização após ultra-cryosectioning. A peroxidase de rábano (HRP) também é uma marca sensível que catalisa a polimerização de H₂o₂dependente de DAB em um precipitado localizado, proporcionando contraste em em após o tratamento com Oso₄. A sequência do peptídeo alvo de ER HRP-KDEL (Lys-Asp-Glu-leu)¹² foi aplicada para visualizar er dentro de uma célula inteira. Para avaliar nosso protocolo de utilização de Tags genéticas e de coloração em bloco com ósmio reduzido e TCH (método rOTO), utilizando o efeito de osmicação ao mesmo tempo, comparamos o contraste da membrana com e sem o uso de cada tag genético na mancha de rOTO en Bloc. Embora 3DEM com tomografia de matriz e coloração DAB com APEX e HRP tenham, respectivamente, sido utilizados para outros fins, nosso protocolo é único porque temos combinado tomografia de matriz para 3DEM e DAB coloração para mitocôndria e ER rotulagem. Especificamente, nós mostramos cinco pilhas com e sem os genes APEX-etiquetados na mesma seção, que ajudada em investigar o efeito da modificação genética em pilhas.