相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

ミトコンドリアおよび小プラズム網膜(ER)は、膜結合細胞小器官である。その接続は、その機能のために必要であり、彼らのネットワークに関連するタンパク質^は1について説明されています。ミトコンドリアとERの間の距離は、光顕微鏡2を用いて約100nmと報告されている。しかし、最近の超解像顕微鏡3および電子顕微鏡(EM)4の研究は、約10〜25nmでかなり小さいことを明らかにした。超解像顕微鏡で達成される分解能はEMより低く、特異的な標識が必要である。EMは、ミトコンドリアとERとの間の接続の構造研究に十分に高分解能コントラストを達成するのに適した技術である。しかし、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)では薄い切片が約60nmまたは薄くなければならないため、Z軸情報が限られているのが不利です。十分なEM Z軸イメージングのために、3次元電子顕微鏡(3DEM)を使用することができる5.しかし、これは、少数の熟練した技術者だけが習得した非常にトリッキーな作業である、細胞全体の薄いシリアルセクションの数百の準備を含みます。これらの薄いセクションは壊れやすいフォルバーフィルムコーティングされた1穴TEMグリッドに集められている。フィルムが1つのガードで壊れた場合、シリアルイメージングとボリュームの再構築は不可能です。シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBEM)は、ダイヤモンドナイフ(Dik-SBEM)または集集型イオンビーム(FIB-SEM)^{のいずれかで走査型電子顕微鏡(SEM)真空チャンバ内の破壊的なブロック断面を使用する3DEMの一般的な技術です。6.}しかし、これらの技術はすべての施設で利用できないため、シリアル断面とSEMを使用して配列断層^撮影7を提案します。アレイ断層撮影では、超マイクロトームを使用して切断されたシリアルセクションは、TEMグリッドの代わりにガラスカバースリップに転送され、光顕微鏡とSEM⁸を介して視覚化されます。バックスキャッタ電子(BSE)イメージングのシグナルを増強するために、四酸化オスミウム(OsO4)固定細胞を用いたen blocEM染色プロトコルを利用し、オスミオフィリックチオカルボヒドラジエード(TCH)9を用いて画像を得ることを可能にした。ポスト埋め込み二重染色。

さらに、ミトコンドリアマーカーSCO1(シトクロムcオキシダーゼ集合タンパク質1)-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)10分子タグを用いて、EMレベルでミトコンドリアを可視化した。APEX2は約28kDaであり、大豆アスコルビン酸ペルオキシダー^ゼ11に由来する。これは、光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質タグ付きタンパク質が使用されるのと同じ方法で、EMレベルでの特定のタンパク質の詳細な位置を示すために開発されました。APEX2は、3,3′ -ジアミノベンジジン(DAB)を、過酸化水素(H2O2)の存在下でタグの部位で不溶性オスミオフィリックポリマーに変換する。APEX2は、細胞全体の深さを通してタンパク質局在化を伴うEMにおける従来の抗体標識の代替として使用することができる。言い換えれば、APEX2タグ付きタンパク質は、超凍結切除後の免疫金標識および透過化なしに、特定の^浸透11によって可視化することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)はまた、H2O-依存性重合DABを局所沈殿物に触媒する敏感なタグであり、OsO₄による処理後のEMコントラストを提供する。ER標的ペプチド配列HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)12を用い、細胞全体でERを可視化した。減少したオスミウムおよびTCH(rOTO法)を用いた遺伝的タグおよびenブロック染色を利用する我々のプロトコルを評価するために、同時にオスミケーション効果を用いて、rOTO enブロック染色における各遺伝的タグの使用の有無にかかわらず膜コントラストを比較した。 アレイ断層撮影とAPEXおよびHRPによるDAB染色を用いた3DEMは、それぞれ他の目的のために利用されていますが、ミトコンドリアおよびERラベリング用の3DEMとDAB染色用の配列断層撮影を組み合わせたため、当社のプロトコルはユニークです。具体的には、APEXタグ付き遺伝子の有無にかかわらず5つの細胞を同じセクションで示し、細胞に対する遺伝子改変の効果を調べに役立った。