Imagerie des mitochondries et du réticulum endoplasmique par microscopie corrélative de lumière et d'électron de volume

Les mitochondries et les réticulums endoplasmiques (ER) sont des organites cellulaires liés à la membrane. Leur connexion est nécessaire pour leur fonction, et les protéines liées à leur réseau ont été décrites¹. La distance entre les mitochondries et les urgences aété rapportée comme étant d’environ 100 nm à l’aide de la microscopie légère 2; cependant, des études récentes de microscopie de super résolution³ et de microscopie électronique (EM)⁴ ont révélé qu’elle était considérablement plus petite, à environ 10-25 nm. La résolution obtenue dans la microscopie de super-résolution est inférieure à EM, et l’étiquetage spécifique est nécessaire. L’EM est une technique appropriée pour atteindre un contraste à résolution suffisamment élevée pour les études structurelles des connexions entre les mitochondries et les urgences. Cependant, un inconvénient est l’information limitée de z-axe parce que les sections minces doivent être approximativement 60 nm ou plus minces pour la microscopie électronique conventionnelle de transmission (TEM). Pour une imagerie suffisamment em z-axe, la microscopie électronique tridimensionnelle (3DEM) peut être utilisée⁵. Cependant, cela implique la préparation de centaines de sections minces série de cellules entières, ce qui est un travail très délicat que seuls quelques technologues qualifiés ont maîtrisé. Ces fines sections sont collectées sur des grilles TEM d’un trou enduites de forme fragiles. Si le film se brise sur une ceinture, l’imagerie en série et la reconstruction de volume n’est pas possible. La microscopie électronique à balayage par blocs en série (SBEM) est une technique populaire pour 3DEM qui utilise la section destructrice en bloc à l’intérieur de la chambre à vide du microscope électronique à balayage (SEM) avec un couteau diamant (Dik-SBEM) ou un faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ⁶. Cependant, parce que ces techniques ne sont pas disponibles à toutes les installations, nous suggérons la tomographie de tableau⁷ utilisant la sectionde série et SEM. Dans la tomographie de tableau, les sections série coupées à l’aide d’un ultramicrotome sont transférées sur un bordereau de verre au lieu d’une grille TEM et visualisées par microscopie légère et SEM⁸. Pour améliorer le signal pour l’imagerie par électron de rétrodiffusion (ESB), nous avons utilisé un protocole de coloration EM en bloc utilisant des cellules fixes d’osmium (OsO₄) avec thiocarbohydrazide osmiophilique (TCH)⁹, nous permettant d’obtenir des images sans post-embedding double coloration.

En outre, le marqueur mitochondrial SCO1 (cytochrome c oxidase protéine d’assemblage 1)MD ascorbate peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ étiquette moléculaire a été utilisé pour visualiser les mitochondries au niveau EM. APEX2 est d’environ 28 kDa et est dérivé de soja ascorbate peroxidase¹¹. Il a été développé pour montrer l’emplacement détaillé de protéines spécifiques au niveau EM de la même manière que la protéine fluorescente verte marquée par la protéine est utilisée dans la microscopie légère. APEX2 convertit 3,3′ -diaminobenzidine (DAB) en polymère osmiophilique insoluble sur le site de l’étiquette en présence du cofactor peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). APEX2 peut être utilisé comme une alternative à l’étiquetage des anticorps traditionnels dans EM, avec une localisation des protéines dans toute la profondeur de la cellule entière. En d’autres termes, la protéine APEX2-étiquetée peut être visualisée par osmication spécifique¹¹ sans étiquetage et perméabilisation d’immunogold après ultra-cryosectioning. Le peroxidase de raifort (HRP) est également une étiquette sensible qui catalyse la polymérisation H₂O₂-dépendante du DAB en un précipité localisé, offrant un contraste EM après le traitement avec OsO₄. La séquence peptide cible ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² a été appliquée pour visualiser les urgences dans une cellule entière. Pour évaluer notre protocole d’utilisation des étiquettes génétiques et de la coloration en bloc avec l’osmium réduit et TCH (méthode rOTO), en utilisant l’effet d’osmication en même temps, nous avons comparé le contraste de membrane avec et sans l’utilisation de chaque étiquette génétique dans la coloration rOTO en bloc. Bien que 3DEM avec la tomographie de tableau et la coloration de DAB avec APEX et HRP aient, respectivement, été employées pour d’autres buts, notre protocole est unique parce que nous avons combiné la tomographie de réseau pour la coloration 3DEM et DAB pour des mitochondries et l’étiquetage d’ER. Plus précisément, nous avons montré cinq cellules avec et sans gènes APEX-marqués dans la même section, qui a aidé à étudier l’effet de la modification génétique sur les cellules.