Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER) son orgánulos celulares ligados a la membrana. Su conexión es necesaria para su función, y las proteínas relacionadas con su red han sido descritas¹. La distancia entre las mitocondrias y la ER se ha notificado en aproximadamente 100 nm utilizando la microscopía de luz²; sin embargo, los recientes estudios de microscopía³ de superresolución y microscopía electrónica (EM)⁴ han revelado que es considerablemente más pequeño, de aproximadamente 10-25 nm. La resolución alcanzada en la microscopía de superresolución es inferior a EM, y el etiquetado específico es necesario. EM es una técnica adecuada para lograr un contraste de alta resolución suficiente para estudios estructurales de las conexiones entre las mitocondrias y la ER. Sin embargo, una desventaja es la información limitada del eje z porque las secciones delgadas deben ser aproximadamente 60 nm o más delgadas para la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM). Para obtener suficientes imágenes del eje z EM, se puede utilizar microscopía electrónica tridimensional (3DEM)⁵. Sin embargo, esto implica la preparación de cientos de secciones seriales delgadas de células enteras, que es un trabajo muy complicado que sólo unos pocos tecnólogos calificados han dominado. Estas secciones delgadas se recogen en rejillas TEM de un solo orificio recubiertas con película de formvar frágiles. Si la película se rompe en una faja, la toma de imágenes en serie y la reconstrucción del volumen no son posibles. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es una técnica popular para 3DEM que utiliza seccionamiento destructivo en bloque dentro de la cámara de vacío del microscopio electrónico de barrido (SEM) con un cuchillo de diamante (Dik-SBEM) o un haz de iones enfocado (FIB-SEM) ⁶. Sin embargo, debido a que esas técnicas no están disponibles en todas las instalaciones, sugerimos la tomografía de matriz⁷ utilizando seccionamiento en serie y SEM. En la tomografía de matriz, las secciones en serie cortadas con un ultramicrotomo se transfieren aun cubreobjetos de vidrio en lugar de a una rejilla TEM y se visualizan mediante microscopía de luz y SEM 8. Para mejorar la señal para la toma de imágenes de electrones de retrodispersión (EEB), utilizamosun protocolo de tinción EM en bloque que emplea células fijas de tetróxido de osmio (OsO 4) con tiocarbohidrazida osmiofílica (TCH)^9,lo que nos permite obtener imágenes sin post-incorporación de doble tinción.

Además, se utilizó el marcador mitocondrial SCO1 (proteína de ensamblaje del citocromo c oxidasa 1)– ascorbato peroxidasa 2 (APEX2)¹⁰ etiqueta molecular para visualizar las mitocondrias a nivel EM. APEX2 es aproximadamente 28 kDa y se deriva de la soja ascorbato peroxidasa¹¹. Fue desarrollado para mostrar la ubicación detallada de proteínas específicas a nivel EM de la misma manera que la proteína etiquetada con proteína fluorescente verde se utiliza en la microscopía ligera. APEX2 convierte 3,3′ -diaminobenzidina (DAB) en un polímero osmiofílico insoluble en el sitio de la etiqueta en presencia del peróxido de hidrógeno cofactor (H₂O₂). APEX2 se puede utilizar como una alternativa al etiquetado tradicional de anticuerpos en EM, con una localización de proteínas a lo largo de toda la célula. En otras palabras, la proteína etiquetada APEX2 se puede visualizar mediante la osmicación específica¹¹ sin etiquetado de inmunooro y permeabilización después de la ultracriosección. La peroxidasa de rábano picante (HRP) es también una etiqueta sensible que cataliza la polimerización dependiente H₂O₂de DAB en un precipitado localizado, proporcionando contraste EM después del tratamiento con OsO_4. La secuencia de péptidos objetivo de ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² se aplicó para visualizar ER dentro de una célula entera. Para evaluar nuestro protocolo de utilización de etiquetas genéticas y tinción en bloque con osmio reducido y TCH (método rOTO), utilizando el efecto de osmication al mismo tiempo, comparamos el contraste de membrana con y sin el uso de cada etiqueta genética en la tinción rOTO en bloc. Aunque 3DEM con tomografía de matriz y tinción DAB con APEX y HRP se han utilizado, respectivamente, para otros fines, nuestro protocolo es único porque hemos combinado la tomografía de matriz para tinción 3DEM y DAB para mitocondrias y etiquetado ER. Específicamente, mostramos cinco células con y sin genes etiquetados con APEX en la misma sección, lo que ayudó a investigar el efecto de la modificación genética en las células.