הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח
Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.
Abstract
מארגני הסלולר, כגון רשתית המיטובית והאנדופלמיק (ER), יוצרים רשת לביצוע מגוון פונקציות. מבנים אלה מעוקל במיוחד מקופלים לצורות שונות כדי ליצור רשת דינמית בהתאם לתנאים הסלולריים. הדמיה של רשת זו בין המיטוגרם ו-ER כבר ניסה להשתמש ברזולוציה סופר פלואורסצנטית הדמיה ומיקרוסקופ אור; עם זאת, הרזולוציה המוגבלת אינה מספיקה להתבונן בקרומים שבין המיטו, ו-ER בפרוטרוט. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור מספק ניגודיות ממברנה טובה רזולוציה בקנה מידה ננו להתבוננות של אורגלים סלולריים; עם זאת, היא צורכת זמן רב במיוחד כאשר מעריכים את מבנה תלת-מימדי (3D) של אורגלים מעוקלים במיוחד. לכן, הבחנו במבנה של המיטוסקופיה ו-ER באמצעות מיקרוסקופ האור אלקטרון (קלם) וטכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות ascorbate peroxidase 2 משופר ומחזרת peroxidase צביעת. שיטה מכתימה בלוקים, מיקרוסקופ סדרתי דק (טומוגרפיה ממוחשבת), והמיקרוסקופיה אלקטרונית של אמצעי האחסון הוחלו כדי להתבונן במבנה התלת-ממדי. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של המיקרוסקופיה אלקטרון תלת-ממד כדי לבצע מחקרים מבניים מפורטים של המיטולוגיה ו-ER.
Introduction
הרשת המיטו, והאנדופלזמית (ER) הן ממברנות סלולאריים מאוגדות. החיבור שלהם הכרחי עבור תפקידם, וחלבונים הקשורים לרשת שלהם תוארו1. המרחק בין המיטוגרם ו-ER דווח כ 100 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אור2; עם זאת, מיקרוסקופ סופר ברזולוציה האחרונות3 ו מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)4 מחקרים חשפו אותו להיות קטן במידה ניכרת, על כ 10-25 ננומטר. הרזולוציה שהושגה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר נמוכה מ-EM, ותיוג ספציפי הוא הכרחי. EM היא טכניקה מתאימה כדי להשיג ניגודיות ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מחקרים מבניים של הקשרים בין מיטוכונמיטוa ו-ER. עם זאת, חיסרון הוא המידע המוגבל של ציר z מכיוון שהסעיפים הדקים חייבים להיות כ-60 ננומטר או דק יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרוני שידור קונבנציונאלי (TEM). עבור הדמיה מספקת של ציר EM z, מיקרוסקופ אלקטרוני תלת מימדי (3DEM) ניתן להשתמש5. עם זאת, זה כולל הכנת מאות חלקים סידוריים דקים של תאים שלמים, וזה עבודה מסובכת מאוד שרק כמה טכנולוגים מיומנים שולט. קטעים דקים אלה נאספים על הסרט formvar שברירי מצופה ברשתות TEM אחד-חור. אם הסרט נשבר על בחורה אחת, הדמיה טורית ושחזור נפח אינו אפשרי. בלוק סדרתי הסורק מיקרוסקופ אלקטרונים (SBEM) היא טכניקה פופולרית עבור 3DEM המשתמשת הרסני בלוקים בתוך המיקרוסקופ אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תא ואקום עם סכין יהלום או (דיכ-SBEM) או קרן יון ממוקדת (פרפור-SEM) 6. עם זאת, כיוון שטכניקות אלה אינן זמינות בכל המתקנים, אנו ממליצים על מערך טומוגרפיה7 באמצעות הגנות סדרתיות ו-SEM. In מערך טומוגרפיה, מקטעים סידוריים לגזור באמצעות ultramicrotome מועברים שמיכות זכוכית במקום רשת TEM ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור SEM8. כדי לשפר את האות עבור הדמיה לאחור (bse) להדמיה, אנו מנוצלים באמצעות שימוש בפרוטוקול של כתמי EM באמצעות השימוש אוסמיום tetroxide (OsO4)-תאים קבועים עם osmi, thiolic הידרזידה (TCH)9, המאפשר לנו להשיג תמונות ללא כתמים כפולים שלאחר ההטבעה.
בנוסף, סמן מיטוכונדריאלי SCO1 (ציטוכרום c אוקסידאז הרכבה חלבון 1) – ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 תג מולקולרי שימש להמחיש המיטו, ברמת EM. APEX2 הוא כ 28 kDa ונגזר מ סויה ascorbate peroxidase11. זה פותחה כדי להראות את המיקום המפורט של חלבונים ספציפיים ברמה EM באותו אופן שבו חלבון פלורסנט ירוק מתויג חלבונים משמש במיקרוסקופ אור. APEX2 ממירה 3, 3 ‘-diaminobenzidine (בתוספת) לתוך פולימר מסיסים אוסמיפילית באתר של התג בנוכחות מימן הקופמי חמצן (H2O2). APEX2 יכול לשמש כחלופה לתיוג נוגדנים מסורתיים EM, עם לוקליזציה חלבון לאורך כל העומק של התא כולו. במילים אחרות, חלבון APEX2 מתויג יכול להיות מדמיינו על ידי ספציפי osmication11 ללא התוויות חיסוני והחדירות לאחר ההקפאה האולטרה. חזרת peroxidase (HRP) הוא גם תג רגיש אשר מזרז את ה-H2O התלויים החומר של התוספת לתוך מהפך מקומי, מתן ניגודיות EM לאחר הטיפול עם OsO4. רצף פפטיד היעד של המטרה HRP-KDEL (ליס-asp-לגלו-leu)12 הוחל על הדמיה של ER בתוך תא שלם. כדי להעריך את הפרוטוקול שלנו של ניצול התגים הגנטיים ואת הגוש בלוקים עם אוסמיום מופחת ו TCH (שיטת roto), באמצעות אפקט osmication באותו זמן, השוונו את הניגודיות הממברנה עם וללא שימוש של כל תג גנטי ב-roto בלוק בלוקים. למרות 3DEM עם טומוגרפיה מערך ו מכתים את השילוב עם איפקס ו HRP יש, בהתאמה, היה מנוצל למטרות אחרות, הפרוטוקול שלנו הוא ייחודי כי יש לנו מערך טומוגרפיה משולבת עבור 3DEM ו-מכתים את השילוב של המיטו, ותיוג ER. באופן ספציפי, הראנו חמישה תאים עם ובלי הגנים מתויגים איפקס באותו סעיף, אשר סייעה בחקירת ההשפעה של השינוי הגנטי על תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
קביעת הלוקליזציה התאית של חלבונים ספציפיים ברזולוציית ננומטר באמצעות EM היא חיונית כדי להבין את הפונקציות הסלולר של חלבונים. בדרך כלל, ישנן שתי טכניקות ללמוד לוקליזציה של חלבון היעד באמצעות EM. אחת היא טכניקת החיסוני זהב, אשר נעשה שימוש EM מאז 1960, והשני הוא טכניקה באמצעות לאחרונה פיתח תגים מק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי התוכנית מחקר בסיסי של KBRI באמצעות קוריאה מכון מחקר המוח ממומן על ידי משרד המדע והתקשוב (19-BR-01-08), וקרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL פלמידס המסופקים באדיבות היאן-וו רי (האוניברסיטה הלאומית של סאול). נתוני TEM נרכשו בבית מחקר המוח מתקנים ליבה ב KBRI.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
