Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie
Summary
We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.
Abstract
Cellulaire organellen, zoals mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER), maken een netwerk om een verscheidenheid van functies uit te voeren. Deze sterk gebogen structuren worden in verschillende vormen gevouwen om een dynamisch netwerk te vormen, afhankelijk van de cellulaire omstandigheden. Visualisatie van dit netwerk tussen mitochondriën en ER is geprobeerd met behulp van super-resolutie fluorescentie Imaging en lichte microscopie; echter, de beperkte resolutie is onvoldoende om te observeren van de membranen tussen de mitochondriën en ER in detail. Transmissie elektronenmicroscopie zorgt voor een goede membraan contrast en nanometer-schaal resolutie voor de waarneming van cellulaire organellen; het is echter uitzonderlijk tijdrovend bij het beoordelen van de driedimensionale (3D) structuur van sterk gebogen organellen. Daarom observeerden we de morfologie van mitochondriën en ER via correlatieve licht-elektronenmicroscopie (CLEM) en volume-elektronenmicroscopie technieken met behulp van verbeterde ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring. Een en bloc-kleurings methode, ultradunne seriële snede (array tomografie) en volume-elektronenmicroscopie werden toegepast om de 3D-structuur te observeren. In dit protocol, we suggereren een combinatie van CLEM en 3D elektronenmicroscopie gedetailleerde structurele studies van mitochondriën en ER uit te voeren.
Introduction
Mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER) zijn membranen gebonden cellulaire organellen. Hun verbinding is noodzakelijk voor hun functie, en eiwitten met betrekking tot hun netwerk zijn beschreven1. De afstand tussen de mitochondriën en ER is gerapporteerd als ongeveer 100 nm met behulp van Lichtmicroscopie2; echter, recente super-resolution microscopie3 en elektronenmicroscopie (em)4 studies hebben aangetoond dat het aanzienlijk kleiner, bij ongeveer 10-25 nm. De resolutie die is bereikt in superresolutie microscopie is lager dan EM, en specifieke labeling is noodzakelijk. EM is een geschikte techniek om een voldoende hoge-resolutie contrast te bereiken voor structurele studies van de verbindingen tussen mitochondriën en ER. Een nadeel is echter de beperkte z-as-informatie, omdat de dunne delen ongeveer 60 Nm of dunner moeten zijn voor conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Voor voldoende EM-z-asbeeldvorming kan drie-dimensionale elektronenmicroscopie (3DEM) worden gebruikt5. Dit impliceert echter de voorbereiding van honderden dunne seriële secties van hele cellen, wat erg lastig werk is dat slechts een paar bekwame technologen onder de knie hebben. Deze dunne delen worden verzameld op fragiele formvar filmomhulde One-hole TEM roosters. Als de film breekt op één gird, is seriële beeldvorming en volume reconstructie niet mogelijk. Serie Block-face scanning electron microscopie (sbem) is een populaire techniek voor 3dem die gebruik maakt van destructief en bloc snijden in de Scanning Electron Microscoop (SEM) vacuümkamer met ofwel een diamantmes (dik-sbem) of een gerichte ionen straal (FIB-SEM) 6. omdat deze technieken echter niet beschikbaar zijn op alle faciliteiten, raden we array computertomografie7 aan met behulp van Serial snij en SEM. In array tomografie worden seriële secties die met behulp van een ultramicrotome worden afgesneden, overgebracht naar een glazen afdekplaat in plaats van een TEM-raster en gevisualiseerd via Lichtmicroscopie en SEM8. Om het signaal voorbeeld vorming met Backscatter Electron (BSE) te verbeteren, gebruikten we een en bloc EM-kleurings protocol met osmium tetroxide (OsO4)-vaste cellen met osmiofiele thiocarbohydrazide (tch)9, waardoor we beelden kunnen verkrijgen zonder dubbele kleuring na inbedding.
Bovendien, de mitochondriale marker SCO1 (cytochroom c oxidase assembly eiwit 1) – ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)10 moleculaire tag werd gebruikt om te visualiseren van mitochondriën op het em-niveau. APEX2 is ongeveer 28 kDa en is afgeleid van soja ascorbaat peroxidase11. Het werd ontwikkeld om de gedetailleerde locatie van specifieke eiwitten op het EM-niveau te tonen, op dezelfde manier dat groen fluorescerend eiwit-gelabeld eiwit wordt gebruikt in lichte microscopie. APEX2 zet 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) om in een onoplosbaar osmiofiele polymeer op de plaats van de tag in aanwezigheid van de cofactor waterstofperoxide (H2O2). APEX2 kan worden gebruikt als alternatief voor traditionele antilichaam etikettering in EM, met een eiwit lokalisatie door de gehele diepte van de hele cel. Met andere woorden, het APEX2-Tagged eiwit kan worden gevisualiseerd door specifieke osmication11 zonder immunogold labeling en permeabilization na Ultra-cryosnijden. Mierikswortelperoxidase (HRP) is ook een gevoelige tag die de H2O2-afhankelijke polymerisatie van DAB in een gelokaliseerd precipitaat KATALYSEERT, waardoor em-contrast wordt gegeven na behandeling met OsO4. De ER-doel peptide sequentie HRP-KDEL (Lys-ASP-glu-Leu)12 werd toegepast om er binnen een hele cel te visualiseren. Om ons protocol te evalueren van het gebruik van genetische Tags en en bloc-kleuring met gereduceerde osmium en TCH (rOTO-methode), met behulp van het osmication-effect op hetzelfde moment, vergeleken we het membraan contrast met en zonder het gebruik van elk genetisch label in rOTO en bloc-kleuring. Hoewel 3dem met array computertomografie en DAB-kleuring met Apex en HRP respectievelijk zijn gebruikt voor andere doeleinden, is ons protocol uniek omdat we array computertomografie hebben gecombineerd voor 3dem en DAB-kleuring voor mitochondriën en er-labeling. Concreet toonden we vijf cellen met en zonder APEX-Tagged genen in dezelfde sectie, die hielp bij het onderzoeken van het effect van de genetische modificatie op cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bepalen van de cellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten bij een nanometer-resolutie met EM is cruciaal om de cellulaire functies van eiwitten te begrijpen. Over het algemeen zijn er twee technieken om de lokalisatie van een doel proteïne via EM te bestuderen. Een daarvan is de immunogold-techniek, die sinds 1960 in EM is gebruikt, en de andere is een techniek die recent ontwikkelde genetisch gecodeerde tags16bevat. Traditionele immunogold-technieken hebben antilichamen geconjugeerde gou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door het KBRI Basic Research Program door het Korea Brain Research Institute gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen en ICT (19-BR-01-08), en de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Korea Government (MSIT) (No. 2019r1a2c1010634). SCO1-APEX2 en HRP-kdel plasmiden werden vriendelijk aangeboden door Hyun-WoO Rhee (Seoul National University). De gegevens van TEM werden verworven bij Brain Research core facilities in KBRI.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
