Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung
Summary
Hierin beschreiben wir zwei Ansätze zur Charakterisierung von Zellpolarisationsereignissen in B-Lymphozyten während der Bildung eines IS. Die erste betrifft die Quantifizierung der Organellenrekrutierung und Zytoskelett-Umlagerungen an der synaptischen Membran. Der zweite ist ein biochemischer Ansatz, um Veränderungen in der Zusammensetzung des Zentrosoms zu charakterisieren, die polarisiert werden, um die Immunsynapse zu polarisieren.
Abstract
Die Erkennung von oberflächengebundenen Antigenen durch den B-Zell-Rezeptor (BCR) löst die Bildung einer Immunsynapse (IS) aus, bei der sowohl signalierte als auch Antigenaufnahme koordiniert werden. Die IS-Bildung beinhaltet eine dynamische Aktin-Umgestaltung, begleitet von der polarisierten Rekrutierung zur synaptischen Membran des Zentromes und der damit verbundenen intrazellulären Organellen wie Lysosomen und des Golgi-Apparats. Erste Stadien der Aktin-Umgestaltung ermöglichen es B-Zellen, ihre Zelloberfläche zu erhöhen und die Menge an Antigen-BCR-Komplexen zu maximieren, die an der Synapse gesammelt werden. Unter bestimmten Bedingungen, wenn B-Zellen Antigene erkennen, die mit starren Oberflächen verbunden sind, ist dieser Prozess mit der lokalen Rekrutierung und Sekretion von Lysosomen gekoppelt, die die Antigenextraktion erleichtern können. Aufgenommene Antigene werden in spezialisierte Endolysosome-Fächer zur Verarbeitung in Peptide verinnerlicht, die zur weiteren Darstellung von T-Helferzellen auf den Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC-II) geladen werden. Daher ist das Studium der Organellendynamik im Zusammenhang mit der Bildung eines IS entscheidend, um zu verstehen, wie B-Zellen aktiviert werden. In diesem Artikel werden wir sowohl bildgebende als auch eine biochemische Technik zur Untersuchung von Veränderungen in der intrazellulären Organellenpositionierung und Zytoskelett-Umlagerungen diskutieren, die mit der Bildung eines IS in B-Zellen verbunden sind.
Introduction
B-Lymphozyten sind ein wesentlicher Bestandteil des adaptiven Immunsystems, das für die Produktion von Antikörpern gegen verschiedene Bedrohungen und eindringende Krankheitserreger verantwortlich ist. Die Effizienz der Antikörperproduktion wird durch die Fähigkeit von B-Zellen bestimmt, Antigene zu erfassen, zu verarbeiten und zu präsentieren, die entweder in einer löslichen oder oberflächengebundenen Form1,2angetroffen werden. Die Erkennung von Antigenen, die an der Oberfläche einer präsentierenden Zelle befestigt sind, durch die BCR führt zur Bildung eines engen interzellulären Kontakts, der ALS IS3,4bezeichnet wird. Innerhalb dieser dynamischen Plattform findet sowohl die BCR-abhängige downstream Signalisierung als auch die Internalisierung von Antigenen in Endolysosome-Fächer statt. Aufgenommene Antigene werden auf MHC-II-Molekülen verarbeitet und zusammengesetzt und anschließend T-Lymphozyten präsentiert. Produktive B-T-Wechselwirkungen, die als B-T-Zellkooperation bezeichnet werden, ermöglichen es B-Lymphozyten, die entsprechendenSignale zu empfangen, die ihre Differenzierung in Antikörper produzierende Plasmazellen oder Gedächtniszellen 8 fördern.
Zwei Mechanismen wurden an der Antigenextraktion durch B-Zellen beteiligt. Die erste stützt sich auf die Sekretion von Proteasen, die von Lysosomen stammen, die an der synaptischen Spalte5,6rekrutiert und fusioniert werden. Die zweite hängt von Myosin IIA-vermittelten Zugkräften ab, die die Invagination von Antigen-haltigen Membranen auslösen, die in Clathrin-beschichteten Gruben verinnerlicht sind7. Die Art der Antigenextraktion beruht auf den physikalischen Eigenschaften der Membran, in der Antigene gefunden werden. Dennoch durchlaufen B-Zellen in beiden Fällen zwei große Umgestaltungsereignisse: die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und die Polarisierung von Organellen zum IS. Actin-Zytoskelett-Remodellierung beinhaltet eine erste Ausbreitungsphase, in der aktinabhängige Vorsprünge an der synaptischen Membran die Oberfläche in Kontakt mit dem Antigen erhöhen. Es folgt eine Kontraktionsphase, in der BCRs, gekoppelt mit Antigenen, im Zentrum des IS durch die konzertierte Aktion von Molekularmotoren und Aktin-Zytoskelett-Remodeling8,9,10 konzentriert werden. 11. Die Polarisation von Organellen beruht auch auf der Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts. Zum Beispiel wird das Zentromat vom Kern entkoppelt, durch lokale Depolymerisation des assoziierten Aktins, die die Neupositionierung dieser Organelle zum IS5,12ermöglicht. In B-Zellen führt die Neupositionierung des Zentromes zu einem Zellpol (IS) die Lysosomenrekrutierung zur synaptischen Membran, die bei Derortion die Extraktion und/oder Verarbeitung von oberflächengebundenen Antigenen erleichtern kann6. Lysosomen, die beim IS rekrutiert werden, werden mit MHC-II angereichert, das die Bildung von Peptid-MHC-II-Komplexen in endosomalen Kompartimenten begünstigt, die den T-Zellen13präsentiert werden sollen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der Golgi-Apparat eng an den IS14rekrutiert wurde, was darauf hindeutet, dass Von Golgi abgeleitete Vesikel aus dem sekretoreichen Pfad an der Antigenextraktion und/oder -verarbeitung beteiligt sein könnten.
Insgesamt sind intrazelluläre Organelle und Zytoskelett-Umlagerungen in B-Zellen während der Synapsenbildung die wichtigsten Schritte, die eine effiziente Antigenerfassung und -verarbeitung ermöglichen, die für ihre weitere Aktivierung erforderlich sind. In dieser Arbeit führen wir detaillierte Protokolle zur Durchführung von Bildgebung und biochemischer Analyse in B-Zellen ein, um die intrazelluläre Remodellierung von Organellen im Zusammenhang mit der Bildung eines IS zu untersuchen. Diese Techniken umfassen: (i) Immunfluoreszenz und Bildanalyse von B-Zellen, die mit antigenbeschichteten Perlen aktiviert sind, und auf antigenbeschichteten Abdeckungen, die die Visualisierung und Quantifizierung intrazellulärer Komponenten ermöglichen, die zum IS mobilisiert werden und (ii ) Isolierung von zentromangereicherten Fraktionen in B-Zellen durch Ultrazentrifugation auf Saccharosegradienten, die die Identifizierung von Proteinen ermöglicht, die mit dem Zentromom assoziiert sind und potenziell an der Regulierung der Zellpolarität beteiligt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine umfassende Methode, um zu untersuchen, wie B-Lymphozyten ihre intrazelluläre Architektur neu organisieren, um die Bildung eines IS zu fördern. Diese Studie umfasst den Einsatz von bildgebenden Verfahren zur Quantifizierung der intrazellulären Verteilung von Organellen, wie Zentrom, Golgi-Apparat und Lysosomen während der B-Zellaktivierung, und wie sie zum IS polarisieren. Zusätzlich beschreiben wir einen biochemischen Ansatz zur Untersuchung von Veränderungen in der Zentromsomenzusammensetzung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. wird durch ein Forschungsstipendium von FONDECYT #1180900 unterstützt. J.I., D.F. und J.L. wurden durch Stipendien der Comisién Nacional de Ciencia y Tecnologa unterstützt. Wir danken David Osorio von der Pontificia Universidad Catélica de Chile für die Videoaufnahme und -bearbeitung.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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