Изучение динамики органелл в В-клетках во время формирования иммунного синапса

B лимфоциты являются неотъемлемой частью адаптивной иммунной системы, ответственной за выработку антител против различных угроз и вторжения патогенов. Эффективность производства антител определяется способностью В-клеток приобретать, обрабатывать и представлять антигены, встречающиесялибо в растворимой или поверхностной форме 1,². Распознавание антигенов, прикрепленных к поверхности клетки представления, БКР, приводит к образованию близкого межклеточного контакта под видом IS^3,4. В рамках этой динамической платформы происходит как BCR-зависимых вниз по течению сигнализации и интернализации антигенов в эндо-лизосомы отсеков происходит. Убранные антигены обрабатываются и собираются на молекулы MHC-II и впоследствии подаются Т-лимфоцитам. Продуктивные B-T взаимодействия, называемые B-T-клеток сотрудничества, позволяют B лимфоцитов для получения соответствующих сигналов, которые способствуют их дифференциации в антитела производства плазматических клеток или клеток памяти⁸.

Два механизма были вовлечены в экстракцию антигена в клетках В. Первый опирается на секрецию протеаз, происходящих из лизосом, которые подвергаются набору и слиянию при синаптической расщелине^5,6. Второй, зависит от Миозина IIA-опосредованных сил, что вызывает вагинацию антигена, содержащего мембраны, которые интернализированы в clathrin покрытием ямы⁷. Режим экстракции антигена зависит от физических свойств мембраны, в которой находятся антигены. Тем не менее, в обоих случаях, В клетки проходят два основных события реконструкции: актиновый цитоскелет реорганизации и поляризации органелл в IS. Actin цитоскелет ремоделирования включает в себя начальную стадию распространения, где актин-зависимых выступов в синаптической мембраны увеличить поверхность в контакте с антигеном. За этим следует фаза сокращения, где BCRs в сочетании с антигенами сосредоточены в центре ИС с согласованным действием молекулярных двигателей и актина цитоскелет ремоделирования^{8,9,10, 11}. Поляризация органелл также опирается на ремоделирование актина цитоскелета. Например, центросома становится отсоединена от ядра, путем локальной деполимеризации ассоциированного актина, что позволяет перепозиционировать эту органель в^{IS 5,12}. В В-клетки, перепозиционирование центросомы на один полюс клетки (IS) направляет лизосомы вербовки в синаптической мембраны, которая при секреции может облегчить добычу и / или обработки поверхностных антигенов⁶. Лисососомы, завербованные в ИГ, обогащаются MHC-II, что способствует образованию пептидных комплексов MHC-II в эндосомальных отсеках, которые будут представлены Т-клеткам^13. Кроме того, было отмечено, что аппарат Голги был тесно завербован в^{IS 14,}предполагая, что пузырьки, полученные голги из секреторного пути, могут быть вовлечены в добычу антигена и/или обработку.

В целом, внутриклеточные органеллы и цитоскелетные перестановки в В-клетках во время формирования синапсов являются ключевыми шагами, которые позволяют эффективное приобретение и обработку антигена, необходимые для их дальнейшей активации. В этой работе мы вводим подробные протоколы о том, как выполнять визуализацию и биохимический анализ в В-клетках для изучения внутриклеточной ремоделирования органелл, связанных с образованием ИС. Эти методы включают: i) иммунофлуоресценцию и анализ изображений В-клеток, активированных с антигеном покрытием бусины и на антиген-покрытие крышки, что позволяет визуализации и количественной внутриклеточной компоненты, которые мобилизованы в ИС и (ii ) изоляция обогащенных центросомой фракций в В-клетках путем ультрацентрифугирования на градиентах сахарозы, что позволяет выявлять белки, связанные с центросомой, потенциально участвующих в регулировании полярности клеток.