Het bestuderen van organelle dynamica in B-cellen tijdens immuun Synapse vorming
Summary
Hierin beschrijven we twee benaderingen om celpolarisatie gebeurtenissen in B-lymfocyten te karakteriseren tijdens de vorming van een IS. De eerste, omvat de kwantificering van organel recruitment en cytoskelet herschikkingen op het synaptische membraan. De tweede is een biochemische benadering, om veranderingen in de samenstelling van het zwaartepunt te karakteriseren, die polarisatie ondergaat op het immuunsysteem Synapse.
Abstract
Herkenning van oppervlaktethering antigenen door de B cell receptor (BCR) activeert de vorming van een immuun Synapse (IS), waar zowel signalering en antigeen opname worden gecoördineerd. Bij de formatie gaat het om dynamische actine-remodellering, begeleid door de gepolariseerde rekrutering van het synaptische membraan van de centrosoom en geassocieerde intracellulaire organellen zoals lysosomen en het Golgi-apparaat. In de eerste stadia van actine-remodellering kunnen B-cellen hun celoppervlak vergroten en de hoeveelheid antigeen-BCR-complexen die in de synaps zijn verzameld maximaliseren. Onder bepaalde omstandigheden, wanneer B-cellen antigenen herkennen die geassocieerd zijn met stijve oppervlakken, is dit proces gekoppeld aan de lokale werving en secretie van lysosomes, die antigeen-extractie kunnen vergemakkelijken. Upingen antigenen zijn geïnternationaliseerd in gespecialiseerde Endo-lysosome compartimenten voor verwerking in peptiden, die worden geladen op grote histocompatibility complex II (MHC-II) moleculen voor verdere presentatie aan T helper cellen. Daarom is het bestuderen van organel dynamiek in verband met de vorming van een is cruciaal om te begrijpen hoe B-cellen worden geactiveerd. In het huidige artikel zullen we zowel beeldvorming als een biochemische techniek bespreken die wordt gebruikt om veranderingen in intracellulaire organel positionering en cytoskelet herschikkingen te bestuderen die geassocieerd zijn met de vorming van een is in B-cellen.
Introduction
B-lymfocyten zijn een essentieel onderdeel van het adaptieve immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor de productie van antilichamen tegen verschillende bedreigingen en binnenvallende pathogenen. De efficiëntie van de productie van antilichamen wordt bepaald door het vermogen van B-cellen om antigenen te verwerven, te verwerken en te presenteren die aangetroffen zijn in een oplosbare of oppervlaktethering vorm1,2. De erkenning van antigenen die aan het oppervlak van een inzend cel zijn gehecht, door de BCR, leidt tot de vorming van een nauwe intercellulaire contact genoemd is3,4. Binnen dit dynamische platform vindt zowel BCR-afhankelijke downstream signalering en internalisatie van antigenen in Endo-lysosome compartimenten plaats. Upingen antigenen worden verwerkt en geassembleerd op MHC-II moleculen en vervolgens gepresenteerd aan T lymfocyten. Productieve B-T-interacties, aangeduid als B-T-celsamenwerking, laten B-lymfocyten de juiste signalen ontvangen, die hun differentiatie in antilichaamproducerende plasmacellen of geheugen cellen8bevorderen.
Er zijn twee mechanismen betrokken bij de extractie van antigeen door B-cellen. De eerste is gebaseerd op de afscheiding van proteasen afkomstig van lysosomen die rekrutering en fusie ondergaan op de synaptische gespleten5,6. De tweede, is afhankelijk van myosin IIA-gemedieerde trekkrachten die de invaginatie van antigeen bevattende membranen die zijn geïnternationaliseerd in een clathrin-gecoate pits7activeert. De methode van antigeen extractie berust op de fysische eigenschappen van het membraan waarin antigenen worden aangetroffen. Niettemin, in beide gevallen, B-cellen ondergaan twee belangrijke remodellering gebeurtenissen: actine cytoskelet reorganisatie en polarisatie van organellen aan de IS. Actin cytoskelet remodellering omvat een initiële verspreiding fase, waarbij actin-afhankelijke uitsteeksels op het synaptische membraan het oppervlak in contact met het antigeen verhogen. Dit wordt gevolgd door een contractie fase, waarbij BCrs in combinatie met antigenen geconcentreerd zijn in het midden van de is door de gecoördineerde werking van moleculaire motoren en actine cytoskelet remodelleren8,9,10, 11. polarisatie van organellen is ook afhankelijk van de verbouwing van actine cytoskelet. Bijvoorbeeld, de centrosoom wordt losgekoppeld van de Nucleus, door lokale depolymerisatie van geassocieerde actin, die het mogelijk maakt de herpositionering van deze organel naar de is5,12. In B-cellen, herpositionering van het zwaartepunt op één celpool (is) begeleidt lysosoom rekrutering naar het synaptische membraan, die bij afscheiding de extractie en/of verwerking van oppervlaktegebonden antigenen6kan vergemakkelijken. Lysosomes aangeworven op de IS zijn verrijkt met MHC-II, die de vorming van peptide-MHC-II complexen in endosomale compartimenten voor te stellen aan T-cellen13gunsten. Bovendien is het Golgi-apparaat ook waargenomen om nauw te worden gerekruteerd aan de IS14, wat suggereert dat Golgi afkomstige blaasjes uit het secretoire traject kunnen worden betrokken bij de extractie en/of verwerking van antigeen.
In totaal zijn intracellulaire organel-en cytoskelet-herschikkingen in B-cellen tijdens de synaps vorming de belangrijkste stappen die een efficiënte antigeen verwerving en verwerking vereist voor hun verdere activering mogelijk maken. In dit werk introduceren we gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van Imaging en biochemische analyse in B-cellen om de intracellulaire remodellering van organellen in verband met de vorming van een IS te bestuderen. Deze technieken omvatten: (i) immunofluorescentie en beeldanalyse van B-cellen die worden geactiveerd met antigeen-gecoate kralen en op antigeen gecoate dekstroken, waardoor visualisatie en kwantificering van intracellulaire componenten die zijn gemobiliseerd aan de IS en (II ) isolatie van met zwaartepunt verrijkte fracties in B-cellen door ultracentrifugatie op sucrose-gradiënten, die de identificatie mogelijk maakt van eiwitten die met het centromeer zijn geassocieerd, mogelijk betrokken bij de regulering van de celpolariteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een uitgebreide methode om te bestuderen hoe B-lymfocyten hun intracellulaire architectuur opnieuw organiseren om de vorming van een IS te bevorderen. Deze studie omvat het gebruik van beeldvormingstechnieken om de intracellulaire verdeling van organellen te kwantificeren, zoals centrosome, Golgi-apparatuur en lysosomen tijdens de activering van B-cellen, en hoe ze polariseren naar de is. Daarnaast beschrijven we een biochemische benadering om veranderingen in de centrosoom samenstelling na B-celactivering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie van FONDECYT #1180900. J.I., D.F. en J.L. werden gesteund door beurzen van de Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. We danken David Osorio van Pontificia Universidad Católica de Chile voor de video-opname en-bewerking.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
