לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית
Summary
כאן אנו מתארים שתי גישות כדי לאפיין את האירועים הקיטוב התא ב לימפוציטים B במהלך היווצרות של IS. הראשון, כולל כימות של גיוס והשלד של ארגון מחדש על הקרום סינפטית. השני הוא גישה ביוכימית, כדי לאפיין שינויים בקומפוזיציה של הסנטרוחלק, אשר עובר קיטוב לסינפסה החיסונית.
Abstract
הכרה של משטח קשור אנטיגנים על ידי קולטן התא B (BCR) מפעיל את היווצרות סינפסה החיסונית (IS), שבו הן ספיגת איתות ו אנטיגן מתואמים. היא היווצרות כולל שיפוץ דינאמי אקטין מלווה גיוס מקוטב לקרום סינפטית של הסנטרוחלק והקשורים לאורגולאים תאיים כגון ליסוזומים ומערכת golgi. בשלבים הראשוניים של שיפוץ אקטין לאפשר לתאי B להגדיל את משטח התא שלהם ולמקסם את כמות אנטיגן-bcr מכלולי התאספו בסינפסה. בתנאים מסוימים, כאשר B תאים מזהים אנטיגנים הקשורים משטחים נוקשים, תהליך זה משולב לגיוס המקומי הפרשה של lysosomes, אשר יכול להקל על החילוץ אנטיגן. אנטיגנים uptaken הם הפנימו לתוך המקצועית ליסוכמה תאים לעיבוד לתוך פפטידים, אשר נטענים על הגדול ביותר היסטוליםקומפלקס מורכבים II (MHC-II) מולקולות עבור מצגת נוספת תאים מסייע T. לכן, לימוד דינמיקה של ארגון הקשור להיווצרות IS הוא חיוני כדי להבין כיצד התאים B מופעלים. במאמר הנוכחי נדון הן בהדמיה והן בטכניקה ביוכימית המשמשת לחקר שינויים במיקום של מיצוב מאורגני ובשלד ציטותאי המשויכים להיווצרות הנמצא בתאי B.
Introduction
לימפוציטים B הם חלק חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית אחראי להפקת נוגדנים נגד איומים שונים והפולשים פתוגנים. היעילות של ייצור נוגדנים נקבעת על ידי היכולת של B תאים כדי לרכוש, התהליך והנוכחי אנטיגנים נתקל או בטופס מסיסים או קשור למשטח1,2. הכרה של אנטיגנים המחוברים אל פני השטח של תא מציג, על ידי bcr, מוביל היווצרות של מגע התרבות קרוב שנקרא הוא3,4. בתוך פלטפורמת דינמי זה הן BCR תלוי במורד הזרם איתות הפנמה של אנטיגנים לתוך אנדו-lysosome תאים מתרחש. אנטיגנים uptaken מעובדים והתאספו על מולקולות MHC-II ולאחר מכן הציגו לימפוציטים T. אינטראקציות ה-B-T פרודוקטיבי, כינה את שיתוף הפעולה של תא B-T, לאפשר B לימפוציטים לקבל את האותות המתאימים, אשר לקדם את הבידול שלהם לתוך מייצרת נוגדנים תאי פלזמה או תאים זיכרון8.
שני מנגנונים היו מעורבים בהפקת אנטיגן על ידי תאי B. הראשון מסתמך על הפרשת הפרוטסים שמקורם ליסוזומים העוברים גיוס והיתוך ב סינפטית שסועה5,6. השני, תלוי ברירן IIA-תיווך מושך כוחות שמפעיל את הפולשים של אנטיגן המכיל ממברנות אשר הפנימו לתוך בורות מצופה clathrin7. המצב של הפקת אנטיגן מסתמך על המאפיינים הפיזיים של קרום שבו אנטיגנים מצויים. אף על פי כן, בשני המקרים, תאי B עוברים שני אירועי שיפוץ עיקריים: התארגנות מארגון השלד הציטומה ופולריזציה של אורגלים ל-IS. השלד הפנימי של actin שיפוצים כרוך שלב התפשטות ראשונית, שם actin תלוי בליטות בקרום סינפטית להגדיל את פני השטח במגע עם האנטיגן. הדבר מלווה בשלב התכווצות, שבו BCRs בשילוב עם אנטיגנים מרוכזים במרכז של זה על ידי פעולה מתואמת של מנועים מולקולריים אקטין שלד מעצב שיפוץ8,9,10, 11. פולריזציה של אורגלים מסתמך גם על שיפוץ של שלד ציטוטין. למשל, הסנטרוחלק הופך להיות בלתי משולב מן הגרעין, על ידי הדפלוניזציה המקומית של actin הקשורים, אשר מאפשר את מיקום מחדש של האורגאל הזה הוא5,12. ב-B תאים, מיקום מחדש של הסנטרוחלק לקוטב תא אחד (IS) מדריכים לגיוס לקרום סינפטית, אשר על הפרשה יכול להקל על החילוץ ו/או עיבוד של אנטיגנים הקשור למשטח6. ליסוזומים שגויס ב IS מועשר עם MHC-II, אשר מעדיף היווצרות של פפטיד-MHC-II מכלולי בתאי אנדוזומבית להיות מוצגים T תאים13. בנוסף, מערכת Golgi נצפתה גם להיות מגויס היטב ל-IS14, הרומז כי golgi נגזר שלפוחיות מן השביל הסוד יכול להיות מעורב בהפקת אנטיגן ו/או עיבוד.
בסך הכל, מארגני התאיים והשלד הציטותאים בתאי B במהלך היווצרות סינפסה הם הצעדים העיקריים המאפשרים רכישת אנטיגן יעיל עיבוד נדרש עבור הפעלה נוספת שלהם. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים על איך לבצע הדמיה וניתוח ביוכימיים בתאי B ללמוד שיפוץ תאיים של אורגלים הקשורים היווצרות של IS. טכניקות אלה כוללות: (i) Immunofluorescence ניתוח תמונה של תאי B המופעל עם מחרוזת אנטיגן מצופה, על הכיסויים אנטיגן מצופה, אשר מאפשר הדמיה וכימות של רכיבים תאיים המגייסו ל IS ו (ii ) בידוד של מספר שברים מועשר ב-B בתאי על ידי הסתבכות על מעברי הצבע של סוכרוז, המאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים ל-centrosome העלולים להיות מעורבים בוויסות קוטביות התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שיטה מקיפה ללמוד כיצד B לימפוציטים לארגן מחדש את הארכיטקטורה תאיים שלהם כדי לקדם את היווצרות של IS. מחקר זה כולל את השימוש בטכניקות הדמיה כדי לכמת את התפלגות תאיים של אורגלים, כגון centrosome מכשירים Golgi ו-lysosomes במהלך הפעלת התא B, וכיצד הם הקיטוב כדי IS. בנוסף, אנו מתארים גישה ביוכימית ללי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. נתמך על ידי מענק מחקר מ FONDECYT1180900. J.I., D.F ו J.L. היו נתמכים על ידי מלגות מתוך האינטרנציונל הלאומי. אנו מודים לדוד אוסוריו מאוניברסיצ קאנוקיה דה צ’ילה להקלטת וידאו ולעריכה.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
