Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

I linfociti B sono una parte essenziale del sistema immunitario adattivo responsabile della produzione di anticorpi contro diverse minacce e dell’invasione degli agenti patogeni. L’efficienza della produzione di anticorpi è determinata dalla capacità delle cellule B di acquisire, elaborare e presentare antigeni incontrati in forma solubile o con tebranda superficiale^1,2. Il riconoscimento degli antigeni attaccati alla superficie di una cellula di presentazione, da parte del BCR, porta alla formazione di uno stretto contatto intercellulare chiamato IS^3,4. All’interno di questa piattaforma dinamica avviene sia la segnalazione a valle dipendente da BCR che l’internalizzazione degli antigeni in compartimenti endososomi. Gli antigeni assorbiti vengono elaborati e assemblati su molecole MHC-II e successivamente presentati ai linfociti T. Le interazioni B-T produttive, definite cooperazione cellulare B-T, permettono ai linfociti B di ricevere i segnali appropriati, che promuovono la loro differenziazione in plasmacellule o celle di memoria che producono anticorpi o cellule di memoria⁸.

Due meccanismi sono stati coinvolti nell’estrazione dell’antigene da parte delle cellule B. Il primo si basa sulla secrezione di proteasi provenienti da lisosomi che subiscono il reclutamento e la fusione presso la fessura sinaptica^5,6. Il secondo, dipende da forze di trazione mediate Myosin IIA che innesca l’invaginazione dell’antigene contenente membrane che sono internalizzate in pozzi rivestiti di clathrin^{7 .} La modalità di estrazione dell’antigene si basa sulle proprietà fisiche della membrana in cui si trovano gli antigeni. Tuttavia, in entrambi i casi, le cellule B subiscono due grandi eventi di rimodellamento: la riorganizzazione del citoscheletro actin e la polarizzazione degli organelli all’IS. Il rimodellamento del citoscheletro actina comporta una fase iniziale di diffusione, in cui le protrusioni dipendenti dall’actina nella membrana sinaptica aumentano la superficie a contatto con l’antigene. Segue una fase di contrazione, in cui le BCR accoppiate con gli antigeni sono concentrate al centro dell’IS dall’azione concertata dei motori molecolari e del rimodellamento del citoscheletro actina^{8,9,10, 11}. La polarizzazione degli organelli si basa anche sulla ristrutturazione del citoscheletro actin. Ad esempio, il centrosore diventa disaccoppiato dal nucleo, dalla depolimerizzazione locale dell’actina associata,che consente il riposizionamento di questo organello all’IS 5,¹². Nelle cellule B, il riposizionamento del centrosore a un polo cellulare (IS) guida il reclutamento di lisomi nella membrana sinaptica, che alla secrezione può facilitare l’estrazione e/o l’elaborazione di antigeni ad essere tesi dalla superficie⁶. I lisosomici reclutati all’IS sono arricchiti da MHC-II, che favorisce la formazione di complessi peptidi-MHC-II in compartimenti endosomici da presentare alle cellule T¹³. Inoltre, l’apparato di Golgi è stato osservato anche per essere reclutato da vicino all’IS¹⁴, suggerendo che le vesciche derivate da Golgi dal percorso secretoria potrebbero essere coinvolte nell’estrazione e/o nella lavorazione degli antigeni.

Complessivamente, i riarrangiamenti intracellulari di organelli e citoscheletri nelle cellule B durante la formazione di sinapsi sono i passi chiave che consentono un’efficiente acquisizione e elaborazione di antigeni necessari per la loro ulteriore attivazione. In questo lavoro introduciamo protocolli dettagliati su come eseguire l’imaging e l’analisi biochimica nelle cellule B per studiare il rimodellamento intracellulare degli organelli associati alla formazione di un IS. Queste tecniche includono: (i) Immunofluorescenza e analisi delle immagini delle cellule B attivate con perline rivestite di antigeni e su coverlips rivestiti di antigeni, che consente la visualizzazione e la quantificazione di componenti intracellulari mobilitati all’IS e (ii ) isolamento delle frazioni arricchite di centrosomi nelle cellule B mediante ultracentrifugazione su gradienti di saccarosio, che consente l’identificazione delle proteine associate al centroso, potenzialmente coinvolto nella regolazione della polarità cellulare.