Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

En las últimas décadas, los métodos de citometría han sido una poderosa herramienta para investigar el sistema hematopoyético en el BM. Estos métodos incluyen la citometría de flujo activada por fluorescencia y el nuevo método de CyTOF utilizando anticuerpos etiquetados con metales pesados. Han dado lugar a descubrimientos de muchos tipos de células en una muestra biológica heterogénea mediante la identificación de sus perfiles únicos de expresión de marcadores de superficie. El aumento de las superposiciones de espectro que se asocia con más canales conduce a una mayor inexactitud de los datos en aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia. Por lo tanto, las células no deseadas se eliminan rutinariamente con el fin de enriquecer las poblaciones celulares de interés para el análisis de citometría de flujo activado por fluorescencia. Por ejemplo, Ly6G (o Gr-1) y CD11b se consideran marcadores de células mieloides maduras y las células Ly6G⁺ (o Gr-1⁺) y CD11b⁺ se eliminan rutinariamente de las muestras de BM mediante el uso de kits de enriquecimiento magnético antes del análisis de citometría de flujo de células hematopoyéticas de tallo y progenitoras (HSCCP) o combinando estos marcadores en un canal de cóctel de volcado^1,2,3. Otro ejemplo es que los neutrófilos se eliminan rutinariamente de la muestra de sangre humana para enriquecer las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para estudios inmunológicos. Sin embargo, la médula ósea entera aislada del ratón o del ser humano rara vez se investiga intacta para el análisis de citometría.

Recientemente, CyTOF se ha convertido en una herramienta revolucionaria para investigar el sistema hematopoyético^4,5,6. Con CyTOF, los anticuerpos etiquetados con fluoróforos son reemplazados por anticuerpos etiquetados con reportero de elementos pesados. Este método permite la medición de más de 40 marcadores simultáneamente sin la preocupación de la superposición de espectro. Ha permitido el análisis de muestras biológicas intactas sin pasos previos al agotamiento o un canal de descarga. Por lo tanto, podemos ver el sistema hematopoyético de forma exhaustiva con dimensionalidad de alto contenido a partir de las gráficas de citometría de flujo 2D convencionales. Las poblaciones celulares omitidas en el pasado durante el proceso de agotamiento o gating ahora pueden ser sacadas a la luz con los datos de alta dimensión generados por CyTOF^4,5. Hemos diseñado un panel de anticuerpos que mide simultáneamente 39 parámetros en el sistema hematopoyético con un enfoque en el linage mieloide⁷. En comparación con los datos convencionales de citometría de flujo, la interpretación y visualización de los datos de alta dimensión de una sola célula sin precedentes generados por CyTOF es un reto. Científicos computacionales han desarrollado técnicas de reducción de dimensionalidad para la visualización de conjuntos de datos de alta dimensión. En este artículo, usamos el algoritmo, viSNE, que utiliza la técnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) para analizar los datos CyTOF y presentar el resultado de alta dimensión en un mapa de 2 dimensiones mientras se conserva la estructura de alta dimensión de los datos^8,9,10. En la gráfica tSNE, las celdas similares se agrupan en subconjuntos y el color se utiliza para resaltar la entidad de las celdas. Por ejemplo, en la Figura 1 las celdas mieloides se distribuyen en varios subconjuntos de celdas en función de las similitudes de sus patrones de expresión de 33 marcadores de superficie resultantes de CyTOF (Figura1)⁴. Aquí investigamos la médula ósea del ratón con nuestro panel CyTOF de 39 marcadores previamente reportado por el análisis de viSNE⁷. El análisis viSNE de nuestros datos CyTOF reveló una población celular no identificada que mostró características de HSPC (CD117⁺) y neutrófilos (Ly6G⁺) (Figura2)⁷.

En conclusión, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea entera fresca para el análisis de CyTOF. En este artículo, utilizamos la médula ósea de ratón como ejemplo, mientras que este protocolo también se puede utilizar para procesar muestras de médula ósea humana. Los detalles específicos de las muestras de médula ósea humana también se observan en el protocolo. La ventaja de este protocolo es que contiene detalles como el tiempo de incubación y la temperatura que fueron optimizados para preservar las células de linaje neutrófilo en toda la médula ósea para permitir la investigación en la médula ósea entera intacta. Este protocolo también se puede modificar fácilmente para aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia.