Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

Negli ultimi decenni, i metodi di citometria sono stati un potente strumento per studiare il sistema ematopoietico nel BM. Questi metodi includono la citometria di flusso attivata dalla fluorescenza e il nuovo metodo di CyTOF che utilizza anticorpi con etichettatura di metalli pesanti. Hanno portato a scoperte di molti tipi di cellule in un campione biologico eterogeneo identificando i loro profili unici di espressione dei marcatori di superficie. L’aumento delle sovrapposizioni di spettro associate a più canali porta a una maggiore imprecisione dei dati nelle applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza. Pertanto, le cellule indesiderate vengono regolarmente rimosse al fine di arricchire le popolazioni cellulari di interesse per l’analisi della citometria del flusso attivata dalla fluorescenza. Ad esempio, I marcatori di cellule mieloidi mature, ad esempio Ly6G (o Gr-1) e CD11b, vengono regolarmente rimossi dai campioni BM utilizzando kit di arricchimento magnetico prima dell’analisi della citometria di flusso cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) o combinando questi marcatori in un unico canale cocktail di scarica^1,2,3. Un altro esempio è che i neutrofili vengono regolarmente rimossi dai campioni di sangue umano per arricchire le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per gli studi immunologici. Il midollo osseo intero isolato dal topo o dall’uomo, tuttavia, è raramente studiato intatto per l’analisi della citometria.

Recentemente, CyTOF è diventato uno strumento rivoluzionario per studiare il sistema ematopoietico^4,5,6. Con CyTOF, gli anticorpi con etichettatura fluoroforo sono sostituiti da anticorpi etichettati come reporter ad elemento pesante. Questo metodo consente la misurazione simultanea di oltre 40 marcatori senza la preoccupazione di sovrapposizione dello spettro. Ha permesso l’analisi di campioni biologici intatti senza passaggi di pre-esaurimento o un canale di scarico. Pertanto, possiamo visualizzare il sistema ematopoietico in modo completo con dimensionalità ad alto contenuto da tradizionali grafici di citometria di flusso 2D. Le popolazioni cellulari omesse in passato durante il processo di deplezione o gating possono ora essere portate alla luce con i dati ad alta dimensione generati da CyTOF^4,5. Abbiamo progettato un pannello anticorpale che misura contemporaneamente 39 parametri nel sistema ematopoietico con un focus sul linaggio mieloide⁷. Rispetto ai dati convenzionali sulla citometria del flusso, l’interpretazione e la visualizzazione dei dati unidimensionali senza precedenti generati da CyTOF è difficile. Scienziati computazionali hanno sviluppato tecniche di riduzione della dimensionalità per la visualizzazione di set di dati ad alta dimensione. In questo articolo è stato utilizzato l’algoritmo viSNE, che utilizza la tecnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) per analizzare i dati CyTOF e per presentare il risultato di alta dimensione su una mappa bidimensionale conservando la struttura ad alta dimensione dei dati^8,9,10. Nel grafico tSNE, celle simili sono raggruppate in sottoinsiemi e il colore viene utilizzato per evidenziare la caratteristica delle celle. Ad esempio, nella Figura 1 le celle mieloidi vengono distribuite in diversi sottoinsiemi di celle in base alle somiglianze dei relativi modelli di espressione di 33 marcatori di superficie risultanti da CyTOF (Figura 1)⁴. Qui abbiamo studiato il midollo osseo del topo con il nostro pannello CyTOF di 39 marcatori segnalato in precedenza dall’analisi viSNE⁷. L’analisi viSNE dei nostri dati CyTOF ha rivelato una popolazionecellulare non identificata che hamostrato caratteristiche sia HSPC (CD117 ) che neutrofili (Ly6G ) (Figura 2)⁷.

In conclusione, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo intero fresco per l’analisi CyTOF. In questo articolo, abbiamo usato il midollo osseo del topo come esempio, mentre questo protocollo può essere utilizzato anche per elaborare campioni di midollo osseo umano. I dettagli specifici per i campioni di midollo osseo umano sono notati anche nel protocollo. Il vantaggio di questo protocollo è che contiene dettagli come il tempo di incubazione e la temperatura che sono stati ottimizzati per preservare le cellule di lignaggio di neutrofili in tutto il midollo osseo per consentire l’indagine sul midollo osseo intero intatto. Questo protocollo può anche essere facilmente modificato per le applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza.