Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

В последние несколько десятилетий, методы цитометрии были мощным инструментом для исследования гематопоетической системы в БМ. Эти методы включают флуоресценцию активированный поток цитометрии и новый метод CyTOF с использованием тяжелых металлов помечены антителами. Они привели к открытиям многих типов клеток в неоднородном биологическом образце, идентифицируя их уникальные профили выражения поверхностных маркеров. Увеличенное перекрытие спектра, связанное с большим количеством каналов, приводит к более высокой неточности данных в приложениях цитометрии с активацией флуоресценции. Таким образом, нежелательные клетки регулярно удаляются для того, чтобы обогатить группы клеток, представляющих интерес для флуоресценции активированный анализ цитометрии потока. Например, Ly6G (или Gr-1) и CD11b считаются зрелыми маркерами миелоидных клеток, а Ly6G (или Gr-1) и CD11b – клетки обычно удаляются из образцов БМ с помощью комплектов магнитного обогащения до анализа цитометрии гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) или путем объединения этих маркеров в одном канале свалки коктейль^1,2,3. Другим примером является то, что нейтрофилы обычно удаляются из образца крови человека, чтобы обогатить периферические моноядерные клетки крови (PBMC) для иммунологических исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши или человека, однако, редко исследуются нетронутыми для анализа цитометрии.

В последнее время CyTOF стал революционным инструментом дляисследования гематопойтической системы 4,^5,6. С CyTOF, флюорофор-маркированные антитела заменены тяжелыми антителами репортер-маркированного элемента. Этот метод позволяет замерить более 40 маркеров одновременно без беспокойства перекрытия спектра. Это позволило провести анализ нетронутых биологических образцов без предистоистой меры или канала свалки. Таким образом, мы можем просматривать гематопоиетическую систему комплексно с высокой объемностью содержания из обычных 2-D потока цитометрии участков. Популяции клеток, опущенные в прошлом во время процесса истощения или gating, теперь могутбыть выведены на свет с помощью высокомерных данных, генерируемых CyTOF 4,⁵. Мы разработали антителой панели, которая одновременно измеряет 39 параметров в гематопоетической системе с акцентом на миелоидный linage⁷. По сравнению с обычными данными цитометрии потока, интерпретация и визуализация беспрецедентных одноклеточных высокомерных данных, генерируемых CyTOF, является сложной задачей. Вычислительные ученые разработали методы уменьшения размерности для визуализации высокомерных наборов данных. В этой статье мы использовали алгоритм viSNE, который использует t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) для анализа данных CyTOF и представления высокомерного результата на 2-мерной карте, сохраняя при этом высокомерную структуру данных^8,9,10. На участке tSNE похожие ячейки группируются в подмножества, и цвет используется для выделения особенностей ячеек. Например, на рисунке 1 миелоидные клетки распределены по нескольким подмножествам клеток на основе сходства их моделей выражения 33 поверхностных маркеров в результате CyTOF (Рисунок 1)⁴. Здесь мы исследовали мыши костного мозга с нашими ранее сообщалось 39-маркер CyTOF панели viSNE анализа⁷. ViSNE анализ наших данных CyTOF показал неопознанную популяцию клеток, которые показали, как HSPC (CD117⁾и нейтрофил (Ly6G⁾характеристики (Рисунок 2)⁷.

В заключение, мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга для анализа CyTOF. В этой статье мы использовали костный мозг мыши в качестве примера, в то время как этот протокол также может быть использован для обработки образцов костного мозга человека. Детали, характерные для образцов костного мозга человека, также отмечены в протоколе. Преимущество этого протокола в том, что он содержит такие детали, как время инкубации и температура, которые были оптимизированы для сохранения нейтрофил-линии клеток в целом костного мозга, чтобы исследование на нетронутыми весь костный мозг. Этот протокол также может быть легко изменен для флуоресценции активированный поток цитометрии приложений.