Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d’écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d’expression de marqueurde de surface. L’augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d’enrichir les populations cellulaires d’intérêt pour l’analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G^(ou Gr-1⁾et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l’aide de kits d’enrichissement magnétique avant l’analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge^1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l’homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l’analyse de cytométrie.

Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique^4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l’analyse d’un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d’un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l’épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF^4,5. Nous avons conçu un panneau d’anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde⁷. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l’interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l’algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données^8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d’expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)⁴. Ici nous avons étudié la moelle d’os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l’analyse^deviSNE 7. l’analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117⁾et neutrophiles (Ly6G⁾(figure2)⁷.

En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l’analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L’avantage de ce protocole est qu’il contient des détails tels que le temps d’incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l’investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.