Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas rotineiramente a fim enriquecer populações da pilha do interesse para a análise fluorescência-ativada do fluxo citometria. Por exemplo, Ly6G (ou GR-1) e CD11b são considerados marcadores de células mielóides maduros e Ly6G⁺ (ou GR-1⁺) e células CD11b⁺ são ROTINEIRAMENTE removidas das amostras de BM usando kits de enriquecimento magnético antes da análise de citometria de fluxo de tronco hematopoiético e células progenitoras (hspcs) ou combinando esses marcadores em um canal de coquetel de despejo^1,2,3. Um outro exemplo é que os neutrófilos são removidos rotineiramente do espécime humano do sangue para enriquecer pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) para estudos imunológicos. A medula óssea inteira isolada do rato ou do ser humano, entretanto, é investigada raramente intact para a análise da citometria.

Recentemente, cytof tornou-se uma ferramenta revolucionária para investigar o sistema hematopoiético^4,5,6. Com CyTOF, os anticorpos etiquetados fluorophore são substituídos por anticorpos repórter-etiquetados do elemento pesado. Este método permite a medição de mais de 40 marcadores simultaneamente sem a preocupação de sobreposição de espectro. Permitiu a análise do espécime biológico intacto sem etapas da pre-depleção ou de uma canaleta da descarga. Portanto, podemos ver o sistema hematopoiético de forma abrangente com dimensionalidade de alto conteúdo a partir de parcelas convencionais de citometria de fluxo 2-D. As populações de células omitidas no passado durante o processo de depleção ou gating agora podem ser trazidas à luz com os dados de alta dimensão gerados pelo cytof^4,5. Nós projetamos um painel do anticorpo que mede simultaneamente 39 parâmetros no sistema hematopoietic com um foco no linage Myeloid⁷. Em comparação com os dados convencionais de citometria de fluxo, a interpretação e visualização dos dados de células unidimensionais sem precedentes gerados pela CyTOF é um desafio. Os cientistas computacionais desenvolveram técnicas de redução de dimensionalidade para a visualização de conjuntos de dados de alta dimensão. Neste artigo, utilizamos o algoritmo viSNE, que utiliza a técnica t-Distributed Stochastic Neighbor incorporação (t-SNE) para analisar os dados CyTOF e apresentar o resultado de alta dimensão em um mapa de 2 dimensões, conservando a estrutura de alta dimensão dos dados^8,9,10. No gráfico tSNE, células semelhantes são agrupadas em subconjuntos e a cor é usada para realçar o recurso das células. Por exemplo, na Figura 1 as células mielóides são distribuídas em vários subconjuntos de células com base nas semelhanças de seus padrões de expressão de 33 marcadores de superfície resultantes de cytof (Figura 1)⁴. Aqui nós investigamos a medula do osso do rato com nosso painel previamente relatado do CyTOF do 39-Marker pela análise⁷de visne. a análise de visne de nossos dados de cytof revelou uma população não identificada da pilha que mostrasse características de hspc (CD117⁺) e de neutrófilos (Ly6G⁺) (Figura 2)⁷.

Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para processar a medula inteira fresca do osso para a análise de CyTOF. Neste artigo, nós usamos a medula óssea do rato como um exemplo, quando este protocolo puder igualmente ser usado para processar amostras humanas da medula. Os detalhes específicos para amostras de medula óssea humana também são observados no protocolo. A vantagem deste protocolo é que contem detalhes tais como o tempo e a temperatura da incubação que foram aperfeiçoados para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem na medula inteira para permitir a investigação na medula inteira intacta do osso. Este protocolo também pode ser facilmente modificado para aplicações de citometria de fluxo ativada por fluorescência.