Guardando verso l'esterno: Isolamento dei polimeri e delle proteine di carboidrati rilasciati in cianobatteria
Summary
Qui, vengono descritti i protocolli per l’isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e l’isolamento dei loro esoproteomi. Entrambe le procedure incorporano i passaggi chiave per ottenere polimeri o proteine con gradi di elevata purezza che possono essere utilizzati per ulteriori analisi o applicazioni. Possono anche essere facilmente adattati in base alle esigenze specifiche dell’utente.
Abstract
I cianobatteri possono secernere attivamente una vasta gamma di biomolecole nell’ambiente extracellulare, come eteropolisaccaridi e proteine. L’identificazione e la caratterizzazione di queste biomolecole può migliorare la conoscenza delle loro vie di secrezione e contribuire a manipolarle. Inoltre, alcune di queste biomolecole sono interessanti anche in termini di applicazioni biotecnologiche. Qui sono descritti due protocolli per un facile e rapido isolamento di polimeri e proteine di carboidrati rilasciati acinobatteri. Il metodo per l’isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati si basa su tecniche convenzionali di precipitazione di polisaccarides in soluzioni acquose che utilizzano solventi organici. Questo metodo conserva le caratteristiche del polimero ed evita contemporaneamente la presenza di contaminanti da detriti cellulari e mezzi di coltura. Alla fine del processo, il polimero lofilofilizzato è pronto per essere utilizzato o caratterizzato o può essere sottoposto a ulteriori cicli di purificazione, a seconda dell’uso previsto finale. Per quanto riguarda l’isolamento dell’esoprotema cianobatterico, la tecnica si basa sulla concentrazione del mezzo privo di cellule dopo la rimozione dei principali contaminanti mediante centrifugazione e filtrazione. Questa strategia consente un isolamento affidabile delle proteine che raggiungono l’ambiente extracellulare tramite trasportatori di membrana o vesciche di membrana esterne. Queste proteine possono essere successivamente identificate utilizzando tecniche standard di spettrometria di massa. I protocolli qui presentati possono essere applicati non solo a una vasta gamma di cianobatteri, ma anche ad altri ceppi batterici. Inoltre, queste procedure possono essere facilmente adattate in base all’uso finale dei prodotti, al grado di purezza richiesto e alla deformazione batterica.
Introduction
I cianobatteri sono ampiamente riconosciuti come fonti prolifiche di prodotti naturali con promettenti applicazioni biotecnologiche/biomediche. Pertanto, la comprensione dei meccanismi di secrezione cianobatterici e l’ottimizzazione dei metodi di estrazione/recupero sono essenziali per implementare i cianobatteri come fabbriche di cellule microbiche efficienti.
Molti ceppi cianobatterici sono in grado di produrre sostanze polimeriche extracellulari (EPS), formate principalmente da eteropolisidi, che rimangono associate alla superficie cellulare o vengono rilasciate nel mezzo1. Questi polimeri di carboidrati rilasciati hanno caratteristiche distinte rispetto a quelle di altri batteri, che li rendono adatti per una vasta gamma di applicazioni (ad esempio, antivirali2, immunostimolatori3 , antiossidanti4, chelazione metallica5, emulsionando6e agenti di somministrazione di farmaci7,8). La metodologia per l’isolamento di questi polimeri contribuisce in gran parte non solo al miglioramento della resa, ma anche ad una maggiore purezza e alle proprietà fisiche specifiche del polimero ottenute9. La stragrande maggioranza di questi metodi per l’isolamento dei polimeri si basa su strategie di precipitazione del mezzo di coltura che sono facilmente realizzabili a causa della forte natura anionica del polimero9,10. Inoltre, la rimozione dei solventi utilizzati nella fase di precipitazione può essere rapidamente ottenuta mediante evaporazione e/o liofilizzazione. A seconda dell’applicazione prevista, è possibile associare diversi passaggi dopo o prima della precipitazione polimerica per personalizzare il prodotto finale, che includono il trattamento dell’acido tricloroacetico (TCA), la filtrazione o la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) purificazione colonna10.
I cianobatteri sono anche in grado di secernere una vasta gamma di proteine attraverso percorsi dipendenti da trasportatori di membrana (classica)11 o mediati da vescicoli (non classici)12. Pertanto, l’analisi dell’esoproteoma cianobatterico costituisce uno strumento essenziale, sia per comprendere/manipolare i meccanismi di secrezione delle proteine cianobatteriche e comprendere la specifica funzione extracellulare di queste proteine. L’isolamento affidabile e l’analisi degli esoproteomi richiedono la concentrazione dell’ambiente extracellulare, poiché l’abbondanza di proteine secrete è relativamente bassa. Inoltre, altri passaggi fisici o chimici (ad esempio, centrifugazione, filtrazione o precipitazioni proteiche) possono ottimizzare la qualità dell’esoproteoma ottenuto, arricchendo il contenuto proteico13,ed evitando la presenza di contaminanti (ad esempio, pigmenti, carboidrati, ecc. 14 Del sistema , 15 o la predominanza delle proteine intracellulari nei campioni. Tuttavia, alcuni di questi passaggi possono anche limitare l’insieme di proteine che possono essere rilevate, portando ad un’analisi di parte.
Questo lavoro descrive protocolli efficienti per l’isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati e degli esoproteomi dai media di coltura dei cianobatteri. Questi protocolli possono essere facilmente adattati agli obiettivi specifici dello studio e alle esigenze degli utenti, pur mantenendo i passaggi di base presentati qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per comprendere meglio i meccanismi di secrezione batterica e studiare i prodotti rilasciati, è di estrema importanza dimostrare l’isolamento efficiente e l’analisi delle biomolecole presenti nell’ambiente batterico extracellulare (come polimeri di carboidrati e proteine).
I polimeri di carboidrati extracellulari cianobatterici sono estremamente complessi, principalmente a causa del numero e della proporzione di monosaccori diversi che costituiscono la loro composizione1</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dai fondi di Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 – Programma Operacional per la competitività e l’internazionalizzazione (POCI), Portogallo 2020, e da fondi portoghesi attraverso FCT – a Tecnologia/Ministério da Cioncia, Tecnologia e Ensino Superior nell’ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-028779 e della sovvenzione SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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