Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outward
Summary
Ici, des protocoles pour l’isolement des polymères de glucides libérés de cyanobactérien et l’isolement de leurs exoprotémomes sont décrits. Les deux procédures incarnent des étapes clés pour obtenir des polymères ou des protéines avec des degrés de haute pureté qui peuvent être utilisés pour une analyse ou des applications plus approfondies. Ils peuvent également être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l’utilisateur.
Abstract
Les cyanobactéries peuvent sécréter activement un large éventail de biomolécules dans l’environnement extracellulaire, comme les hétéropolysaccharides et les protéines. L’identification et la caractérisation de ces biomolécules peuvent améliorer les connaissances sur leurs voies de sécrétion et aider à les manipuler. En outre, certaines de ces biomolécules sont également intéressantes en termes d’applications biotechnologiques. Décrit ici sont deux protocoles pour l’isolement facile et rapide des polymères et des protéines de hydrate de carbone libérés de cyanobacterial. La méthode d’isolement des polymères de glucides libérés est basée sur les techniques conventionnelles de précipitation des polysaccharides dans des solutions aqueuses utilisant des solvants organiques. Cette méthode préserve les caractéristiques du polymère et évite simultanément la présence de contaminants provenant des débris cellulaires et du milieu de culture. À la fin du processus, le polymère lyophilisé est prêt à être utilisé ou caractérisé ou peut être soumis à d’autres tours de purification, selon l’utilisation finale prévue. En ce qui concerne l’isolement de l’exoprotéome cyanobactérien, la technique est basée sur la concentration du milieu sans cellules après l’élimination des principaux contaminants par centrifugation et filtration. Cette stratégie permet un isolement fiable des protéines qui atteignent le milieu extracellulaire par l’intermédiaire de transporteurs membranaires ou de vésicules de membrane externe. Ces protéines peuvent être identifiées par la suite à l’aide de techniques standard de spectrométrie de masse. Les protocoles présentés ici peuvent être appliqués non seulement à un large éventail de cyanobactéries, mais aussi à d’autres souches bactériennes. En outre, ces procédures peuvent être facilement adaptées en fonction de l’utilisation finale des produits, degré de pureté requis, et souche bactérienne.
Introduction
Les cyanobactéries sont largement reconnues comme des sources prolifiques de produits naturels avec des applications biotechnologiques/biomédicales prometteuses. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de sécrétion cyanobactérienne et l’optimisation des méthodes d’extraction/récupération sont essentielles pour mettre en œuvre des cyanobactéries en tant qu’usines efficaces de cellules microbiennes.
De nombreuses souches cyanobactériennes sont capables de produire des substances polymères extracellulaires (EPS), principalement formées par des hétéropolysaccharides, qui restent associées à la surface cellulaire ou sont libérées dans le milieu1. Ces polymères de glucides libérés ont des caractéristiques distinctes par rapport à ceux d’autres bactéries, qui les rendent appropriés pour un large éventail d’applications (par exemple, les antiviraux2, immunostimulatoire3, antioxydant4, métal-chéating5, émulsionnant6, et les agents de livraison de médicaments7,8). La méthodologie pour l’isolement de ces polymères contribue en grande partie non seulement à l’amélioration du rendement, mais aussi à l’augmentation de la pureté et les propriétés physiques spécifiques du polymère obtenu9. Une grande majorité de ces méthodes d’isolement des polymères s’appuient sur des stratégies de précipitation du milieu de culture qui sont facilement réalisées en raison de la forte nature anionique du polymère9,10. En outre, l’élimination des solvants utilisés dans l’étape de précipitation peut être rapidement réalisée par évaporation et/ou lyophilisation. Selon l’application prévue, différentes étapes peuvent être couplées après ou avant la précipitation de polymère afin d’adapter le produit final, qui incluent le traitement d’acide trichloroacétique (TCA), la filtration, ou la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) la purification de colonne10.
Les cyanobactéries sont également capables de sécrétiser un large éventail de protéines à travers des voies dépendantes des transporteurs membranaires (classiques)11 ou médiées par des vésicules (non classiques)12. Par conséquent, l’analyse de l’exoprotéome cyanobactérien constitue un outil essentiel, à la fois pour comprendre / manipuler les mécanismes de sécrétion de protéines cyanobactériennes et de comprendre la fonction extracellulaire spécifique de ces protéines. L’isolement et l’analyse fiables des exoprotéméomes exigent la concentration du milieu extracellulaire, puisque l’abondance des protéines sécrétées est relativement faible. En outre, d’autres étapes physiques ou chimiques (p. ex. centrifugation, filtration ou précipitation sinique) peuvent optimiser la qualité de l’exoprotémome obtenu, enrichir la teneur en protéines13et éviter la présence de contaminants (p. ex., pigments, glucides, etc. ) 14 (en) , 15 ou la prédominance des protéines intracellulaires dans les échantillons. Cependant, certaines de ces étapes peuvent également restreindre l’ensemble de protéines qui peuvent être détectées, conduisant à une analyse biaisée.
Ce travail décrit des protocoles efficaces pour l’isolement des polymères et exoprotéomes de glucides libérés des médias de culture de cyanobactéries. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés aux objectifs spécifiques de l’étude et aux besoins des utilisateurs, tout en maintenant les étapes de base présentées ici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour mieux comprendre les mécanismes de sécrétion bactérienne et étudier les produits libérés, il est d’une extrême importance de démontrer l’isolement efficace et l’analyse des biomolécules présentes dans l’environnement bactérien extracellulaire (tels que libérés polymères et protéines).
Les polymères de glucides extracellulaires cyanobactériens sont extrêmement complexes, principalement en raison du nombre et de la proportion de différents monosaccharides qui constituent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par les fonds fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) par le biais du PROGRAMME competecional pour la compétitivité et l’internationalisation (POCI), Portugal 2020, et par des fonds portugais par l’intermédiaire de la FCT – Fundaço para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet POCI-01-0145-FEDER-028779 et de la subvention SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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