Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten
Summary
Hier worden protocollen voor de isolatie van cyanobacteriële vrijkomende koolhydraatpolymeren en isolatie van hun exoproteomes beschreven. Beide procedures belichamen belangrijke stappen voor het verkrijgen van polymeren of eiwitten met hoge zuiverheids graden die kunnen worden gebruikt voor verdere analyse of toepassingen. Ze kunnen ook eenvoudig worden aangepast aan de specifieke behoeften van de gebruiker.
Abstract
Cyanobacteriën kunnen een breed scala van biomoleules actief afscheiden in de extracellulaire omgeving, zoals heteropolysacchariden en eiwitten. De identificatie en karakterisering van deze biomoleules kan de kennis over hun secretie trajecten verbeteren en helpen om ze te manipuleren. Bovendien zijn sommige van deze biomoleules ook interessant in termen van biotechnologische toepassingen. Hier beschreven zijn twee protocollen voor eenvoudige en snelle isolatie van cyanobacteriële vrijgekomen koolhydraatpolymeren en eiwitten. De methode voor isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren is gebaseerd op conventionele precipitatie technieken van polysacchariden in waterige oplossingen met behulp van organische oplosmiddelen. Deze methode behoudt de eigenschappen van het polymeer en vermijdt tegelijkertijd de aanwezigheid van verontreinigingen uit celvuil en kweekmedium. Aan het einde van het proces is het gelyofiliseerd polymeer klaar om te worden gebruikt of gekarakteriseerd of kan het worden onderworpen aan verdere zuiverings rondes, afhankelijk van het uiteindelijke beoogde gebruik. Met betrekking tot de isolatie van het cyanobacteriële exoproteome, is de techniek gebaseerd op de concentratie van het cel vrije medium na verwijdering van de grote verontreinigingen door centrifugeren en filtratie. Deze strategie zorgt voor een betrouwbare isolatie van eiwitten die de extracellulaire milieu bereiken via membraan transporteurs of buitenste membraan blaasjes. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met behulp van standaard massaspectrometrie technieken. De hier gepresenteerde protocollen kunnen niet alleen worden toegepast op een breed scala aan cyanobacteriën, maar ook op andere bacteriële stammen. Bovendien kunnen deze procedures eenvoudig worden aangepast aan het uiteindelijke gebruik van de producten, de vereiste zuiverheid en de bacteriestam.
Introduction
Cyanobacteriën worden alom erkend als productieve bronnen van natuurlijke producten met veelbelovende biotechnologische/biomedische toepassingen. Daarom zijn het begrijpen van cyanobacteriële secretie mechanismen en optimalisatie van de extractie/herstelmethoden essentieel om cyanobacteriën te implementeren als efficiënte microbiële celfabrieken.
Veel cyanobacteriële stammen zijn in staat om extracellulaire polymere stoffen (EPS) te produceren, voornamelijk gevormd door heteropolysacchariden, die verbonden blijven met het celoppervlak of vrijkomen in het medium1. Deze vrijgegeven koolhydraatpolymeren hebben verschillende kenmerken in vergelijking met die van andere bacteriën, die ze geschikt maken voor een breed scala aan toepassingen (bijv. antivirale middelen2, immunostimulerende3, antioxidant4, metaal-chelating5, emulgerende6, en drug delivery agenten7,8). Methodologie voor de isolatie van deze polymeren draagt niet alleen bij tot een betere opbrengst, maar ook tot meer zuiverheid en de specifieke fysische eigenschappen van het verkregen polymeer9. Een overgrote meerderheid van deze methoden voor isolatie van de polymeren is afhankelijk van neerslag strategieën uit het cultuurmedium die gemakkelijk kunnen worden bereikt door de sterke anionische natuur van het polymeer9,10. Bovendien kan het verwijderen van de oplosmiddelen die in de precipitatie stap worden gebruikt, snel worden bereikt door verdamping en/of lyofilisatie. Afhankelijk van de voorziene toepassing, kunnen verschillende stappen worden gekoppeld, hetzij na of vóór polymeer precipitatie om het eindproduct af te stemmen, waaronder Trichloorazijnzuur (TCA) behandeling, filtratie of grootte uitsluitings chromatografie (SEC) kolom zuivering10.
Cyanobacteriën kunnen ook een breed scala aan eiwitten afscheiden door middel van trajecten die afhankelijk zijn van membraan transporteurs (klassiek)11 of gemedieerd door blaasjes (niet-klassiek)12. Daarom vormt de analyse van het cyanobacteriële exoproteome een essentieel hulpmiddel om de cyanobacteriële eiwit secretie mechanismen te begrijpen/manipuleren en de specifieke extracellulaire functie van deze eiwitten te begrijpen. Betrouwbare isolatie en analyse van exoproteomes vereisen de concentratie van de extracellulaire milieu, omdat de overvloed van uitgescheiden eiwitten relatief laag is. Daarnaast kunnen andere fysische of chemische stappen (bijv. centrifugeren, filtratie of eiwit precipitatie) de kwaliteit van het verkregen exoproteome optimaliseren, het eiwitgehalte13verrijken en de aanwezigheid van verontreinigingen vermijden (bijv. pigmenten, koolhydraten, enz.) 14 , 15 of het overwicht van intracellulaire eiwitten in de monsters. Echter, sommige van deze stappen kunnen ook beperken de set van eiwitten die kunnen worden gedetecteerd, leidt tot een bevooroordeelde analyse.
Dit werk beschrijft efficiënte protocollen voor de isolatie van vrijgekomen koolhydraatpolymeren en exoproteomes van cyanobacteriën culture media. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan de specifieke doelstellingen van de studie en de behoeften van de gebruiker, met behoud van de basisstappen die hier worden gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om de bacteriële secretie mechanismen beter te begrijpen en de vrijgegeven producten te bestuderen, is het van extreem belang om de efficiënte isolatie en analyse van de in de extracellulaire bacteriële omgeving aanwezige biomoleules te demonstreren (zoals vrijgegeven koolhydraatpolymeren en eiwitten).
Cyanobacteriële extracellulaire koolhydraatpolymeren zijn uiterst complex, voornamelijk als gevolg van het aantal en de proportie van verschillende monosacchariden die samenstelling<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) fondsen via het wedstrijd 2020-Operacional programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal 2020, en door Portugese fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e een Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino superieur in het kader van het project POCI-01-0145-FEDER-028779 en de Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
