Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen
Summary
Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.
Abstract
Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.
Introduction
Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.
Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium1freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel2, immunstimulierend3, Antioxidans4, Metall-Chelatierung5, emulgierend6, und Drogen-Liefermittel7,8). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers9. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind9,10. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung10.
Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)11 oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)12zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt13anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) 14 , 15 oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.
Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um bakterielle Sekretionsmechanismen besser zu verstehen und die freigesetzten Produkte zu untersuchen, ist es von größter Bedeutung, die effiziente Isolierung und Analyse der Biomoleküle in der extrazellulären bakteriellen Umgebung (z. B. freigesetzte Kohlenhydratpolymere und Proteine).
Cyanobakterielle extrazelluläre Kohlenhydratpolymere sind extrem komplex, vor allem aufgrund der Anzahl und des Anteils verschiedener Monosaccharide, die ihre Zusammensetzung bilden1</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde aus Fondso Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln über das COMPETE 2020 – Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, und aus portugiesischen Fonds über FCT – Fundaéo para a Ciéncia e finanziert. ein Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-028779 und des Zuschusses SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
