外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離
Summary
ここで、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーの単離およびエキソプロテオームの単離に関するプロトコルが記載されている。両方の手順は、さらなる分析または用途に使用できる高純度のポリマーまたはタンパク質を得るための重要なステップを具体化します。それらはまた特定のユーザーの必要性に従って容易に合わせることができる。
Abstract
シアノバクテリアは、ヘテロ多糖やタンパク質などの細胞外環境に幅広い生体分子を積極的に分泌することができます。これらの生体分子の同定と特徴付けは、それらの分泌経路に関する知識を改善し、それらを操作するのに役立ちます。さらに、これらの生体分子のいくつかは、バイオテクノロジーの応用の面でも興味深い。ここで説明するシアノバクテリア放出炭水化物ポリマーおよびタンパク質の容易かつ迅速な単離のための2つのプロトコルがある。放出された炭水化物ポリマーの単離方法は、有機溶媒を用いた水溶液中の多糖類の従来の沈殿技術に基づいている。この方法は、ポリマーの特性を保持し、同時に細胞破片および培養培地からの汚染物質の存在を回避する。プロセスの終わりに、凍結乾燥ポリマーは、使用または特徴付けされる準備ができているか、または最終意図された使用に応じて、更なる精製のラウンドを受けることができる。シアノバクテリアエキソプロテオームの単離に関して、この技術は遠心分離および濾過による主要な汚染物質の除去後の無細胞培地の濃度に基づいている。この戦略は、膜トランスポーターまたは外膜小胞を介して細胞外のmilieuに達するタンパク質の信頼性の高い単離を可能にします。これらのタンパク質は、その後、標準的な質量分析技術を使用して同定することができる。ここで提示されるプロトコルは、幅広いシアノバクテリアだけでなく、他の細菌株にも適用することができる。さらに、これらの手順は、製品の最終使用、必要な純度、および細菌株に応じて容易に調整することができます。
Introduction
シアノバクテリアは、有望なバイオテクノロジー/バイオメディカルアプリケーションを持つ天然物の多産源として広く認識されています。そのため、シアノバクテリアの分泌機構を理解し、抽出・回収方法の最適化を行うには、効率的な微生物細胞工場としてシアノバクテリアを実装することが不可欠です。
多くのシアノバクテリア株は、細胞外高分子物質(EPS)を産生することができ、主にヘテロ多糖類によって形成され、細胞表面に関連したままであるか、または培地1に放出される。これらの放出された炭水化物ポリマーは、他の細菌のものと比較して特徴があり、幅広い用途(例えば、抗ウイルス剤2、免疫刺激3、抗酸化4、抗酸化剤)に適しています。金属キレート5、乳化6、および薬物送達剤7、8)。これらのポリマーの単離のための方法論は、主に収率の向上に寄与するだけでなく、得られたポリマーの純度および特定の物理的特性の増加に寄与する9.ポリマーの単離のためのこれらの方法の大半は、ポリマーの強いアニオン性質9、10のために容易に達成される培養培地からの降水戦略に依存する。さらに、沈殿工程で使用される溶媒の除去は、蒸発および/または凍結乾燥によって迅速に達成することができる。予見された用途に応じて、トリクロロ酢酸(TCA)処理、濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含む最終製品を調整するために、ポリマー沈殿後または前に異なるステップを結合することができます。列浄化10.
シアノバクテリアはまた、膜トランスポーター(古典的)11または小胞(非古典的)12に媒介される経路を介してタンパク質の広い範囲を分泌することができる。したがって、シアノバクテリアエキソプロテオームの分析は、シアノバクテリアタンパク質分泌機構を理解/操作し、これらのタンパク質の特異的な細胞外機能を理解するために不可欠なツールを構成する。分泌タンパク質の豊富さは比較的低いので、エキソプロテオームの信頼性の高い単離および分析は、細胞外milieuの濃度を必要とする。加えて、他の物理的または化学的ステップ(例えば、遠心分離、濾過、またはタンパク質沈殿)は、得られるエキソプロテオームの品質を最適化し、タンパク質含有量13を濃縮し、汚染物質の存在を回避し得る(例えば、顔料、炭水化物など)14歳,15またはサンプル中の細胞内タンパク質の優位性。しかし、これらのステップの一部は、検出可能なタンパク質のセットを制限し、偏った分析につながる可能性があります。
本研究では、シアノバクテリア培養培地から放出された炭水化物ポリマーとエキソプロテオームを単離するための効率的なプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、ここで説明する基本的な手順を維持しながら、研究の特定の目的とユーザーのニーズに簡単に適応できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌分泌機構をよりよく理解し、放出された製品を研究するためには、細胞外細菌環境に存在する生体分子の効率的な単離と分析を実証することが極めて重要です(放出など)炭水化物ポリマーおよびタンパク質)。
シアノバクテリア細胞外炭水化物ポリマーは、主にその組成1を構成する異なる単糖類の数および割合に起因する非常に複雑である。これら?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、コンペ2020-競争力と国際化のためのオペラプログラム(POCI)、ポルトガル2020、FCTを通じてポルトガルのファンドによって資金提供されたフンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)ファンドによって資金提供されました – フンダサン・パラ・シエンシアeテクノロジア/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリアは、プロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-028779および助成金SFRH/BD/99715/2014(CF)の枠組みの中でスーペリア。
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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