يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات
Summary
هنا ، يتم وصف بروتوكولات لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الطاردة السماوية وعزل exoproteomes الخاصة بهم. ويجسد كلا الإجراءين خطوات رئيسية للحصول على البوليمرات أو البروتينات ذات درجات النقاء العالية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليل أو التطبيقات. ويمكن أيضا تكييفها بسهولة وفقا لاحتياجات المستخدم محددة.
Abstract
يمكن أن تفرز البكتيريا السماوية بنشاط مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في البيئة خارج الخلية، مثل السكريات غير المتجانسة والبروتينات. يمكن لتحديد وتوصيف هذه الجزيئات الحيوية تحسين المعرفة حول مسارات إفرازها وتساعد على التلاعب بها. وعلاوة على ذلك، فإن بعض هذه الجزيئات الحيوية مثيرة للاهتمام أيضا من حيث تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا اثنين من بروتوكولات العزل السهل والسريع للبوليمرات الكربوهيدرات المنكتيرية المفرج عنها والبروتينات. وتستند طريقة عزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة على تقنيات هطول الأمطار التقليدية من السكريات في الحلول المائية باستخدام المذيبات العضوية. تحافظ هذه الطريقة على خصائص البوليمر وتتجنب في الوقت نفسه وجود الملوثات من حطام الخلايا والثقافة المتوسطة. في نهاية العملية، البوليمر الليوفيل على استعداد لاستخدامها أو وصفها أو يمكن أن تخضع لجولات أخرى من تنقية، اعتمادا على الاستخدام النهائي المقصود. وفيما يتعلق بعزل الإكسبروتيوم السيانوبكتيري، تقوم هذه التقنية على تركيز الوسيط الخالي من الخلايا بعد إزالة الملوثات الرئيسية عن طريق الطرد المركزي والترشيح. تسمح هذه الاستراتيجية لعزل موثوق بها من البروتينات التي تصل إلى الوسط خارج الخلية عن طريق ناقلات الغشاء أو الحويصلات الغشاء الخارجي. ويمكن تحديد هذه البروتينات في وقت لاحق باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي القياسية. البروتوكولات المعروضة هنا يمكن تطبيقها ليس فقط على مجموعة واسعة من البكتيريا السماوية، ولكن أيضا على سلالات البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الإجراءات مصممة بسهولة وفقا للاستخدام النهائي للمنتجات، ودرجة النقاء المطلوبة، والإجهاد البكتيري.
Introduction
ومن المسلم به على نطاق واسع البكتيريا السماوية كمصادر وافرة من المنتجات الطبيعية مع التطبيقات الواعدة للتكنولوجيا الحيوية / الطبية الحيوية. ولذلك، فهم آليات إفراز السيانوبكتيرية وتحسين أساليب الاستخراج / الاستعادة ضرورية لتنفيذ البكتيريا السماوية كمصانع الخلايا الميكروبية فعالة.
العديد من سلالات الخلايا القادرة على إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، التي شكلت أساسا من قبل السكريات heteropolysacrides، التي لا تزال مرتبطة سطح الخلية أو يتم تحريرها في المتوسط1. هذه البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة لها ميزات متميزة بالمقارنة مع تلك التي من البكتيريا الأخرى، والتيتجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات (على سبيل المثال، مضادات الفيروسات 2، المحفزات المناعية3،مضادات الأكسدة4، المعادن- تلاوة5،استحلاب6،ووكلاء تسليم المخدرات7،8). منهجية لعزل هذه البوليمرات يساهم إلى حد كبير ليس فقط لتحسين الغلة ولكن أيضا لزيادة النقاء والخصائص الفيزيائية المحددة للبوليمر التي تم الحصول عليها9. الغالبية العظمى من هذه الأساليب لعزل البوليمرات تعتمد على استراتيجيات هطول الأمطار من وسط الثقافة التي يتم إنجازها بسهولة بسبب طبيعة البوليمر الأيونية القوية9،10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحقق بسرعة إزالة المذيبات المستخدمة في خطوة هطول الأمطار عن طريق التبخر و / أو الليونفيلية. اعتمادا على التطبيق المتوقع، يمكن أن يقترن خطوات مختلفة إما بعد أو قبل هطول الأمطار البوليمر من أجل تكييف المنتج النهائي، والتي تشمل حمض ثلاثي كلور والخليك (TCA) العلاج، والترشيح، أو حجم استبعاد اللونية (SEC) تنقية العمود10.
البكتيريا السماوية هي أيضا قادرة على إفراز مجموعة واسعة من البروتينات من خلال مسارات تعتمد على ناقلات الغشاء (الكلاسيكية)11 أو بوساطة الحويصلات (غير الكلاسيكية)12. ولذلك، فإن تحليل exoproteome سيانوبكتيريك يشكل أداة أساسية، سواء لفهم / التلاعب آليات إفراز البروتين السماوي وفهم وظيفة محددة خارج الخلية من هذه البروتينات. العزلة الموثوقة وتحليل exoproteomes تتطلب تركيز الوسط خارج الخلية، لأن وفرة البروتينات التفرز منخفضة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، قد تعمل الخطوات الفيزيائية أو الكيميائية الأخرى (مثل الطرد المركزي أو الترشيح أو هطول الأمطار البروتيني) على تحسين نوعية exoproteome التي تم الحصول عليها، مما يثري محتوى البروتين13،ويتجنب وجود الملوثات (على سبيل المثال، أصباغ، والكربوهيدرات،الخ.) 14 سنة , 15 أو غلبة البروتينات داخل الخلايا في العينات. ومع ذلك، قد تقيد بعض هذه الخطوات أيضًا مجموعة البروتينات التي يمكن اكتشافها، مما يؤدي إلى تحليل متحيز.
يصف هذا العمل بروتوكولات فعالة لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة وexoproteomes من وسائل الإعلام ثقافة السيانوبكتريا. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة مع الأهداف المحددة للدراسة واحتياجات المستعملين، مع الحفاظ على الخطوات الأساسية المعروضة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لفهم آليات إفراز البكتيريا بشكل أفضل ودراسة المنتجات الصادرة، فمن الأهمية بمكان لإظهار العزلة الفعالة وتحليل الجزيئات الحيوية الموجودة في البيئة البكتيرية خارج الخلية (مثل الإفراج البوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات).
البوليمرات الكربوهيدرات الخلوية خارج الخلية معقدة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من صناديق الصندوق الأوروبي للمشاريع الإقليمية من خلال برنامج COMPETE 2020 – Operacional للقدرة التنافسية والتدويل، البرتغال 2020، ومن الأموال البرتغالية من خلال FCT – Fundação para a Ciência e (أ) Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the project POCI-01-0145-FEDER-028779 and grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
