Um protocolo para criar pseudoislets humanos modificados gene das pilhas de ilhotas humanas dispersas que são transados pelo Lentivirus que carreg o RNA curto do hairpin (shRNA) é apresentado. Este protocolo utiliza prontamente-as embarcações disponíveis da enzima e da cultura, podem ser executadas facilmente, e produzem os pseudoislets humanos genetically modificados apropriados para estudos funcionais e morfológicos.
Várias ferramentas genéticas estão disponíveis para modular genes em Ilhéus pancreáticos de roedores para dissecar a função de genes de ilhotas para pesquisa de diabetes. No entanto, os dados obtidos a partir de ilhotas de roedores muitas vezes não são totalmente reproduzidos ou aplicáveis às ilhotas humanas devido a diferenças bem conhecidas na estrutura e função da ilhós entre as espécies. Atualmente, as técnicas que estão disponíveis para manipular a expressão gênica de ilhotas humanas são muito limitadas. A introdução de transgene em ilhotas intactas por adenovirus, plasmídeo, e oligonucleotídeos muitas vezes sofre de baixa eficiência e alta toxicidade. A baixa eficiência é especial problemática em estudos do downregulation do gene em ilhotas intactas, que exigem a eficiência elevada. Soube-se que as pilhas enzymaticamente-dispersadas do Islet reagregam na cultura que dá forma aos esferoides denominados pseudoislets. O Reaggregation tamanho-controlado de pilhas humanas da ilhotas cria os pseudoislets que mantêm a primeira secreção dinâmica da insulina da fase após a cultura prolongada e fornecem uma janela para introduzir eficientemente o RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) com baixa toxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a criação de pseudoislets humanos após o transdução lentivirais usando duas placas de comercialmente disponíveis é descrito. O protocolo pode ser facilmente realizado e permite a downregulation eficiente dos genes e a avaliação do dinamismo da secreção de insulina usando células de Illet humanas. Assim, os pseudoislets humanos com modulação mediada lentivirais do gene fornecem um modelo poderoso e versátil para avaliar a função do gene dentro das pilhas humanas da ilhotas.
A perda da massa beta funcional da pilha é a patologia central para o tipo-1 e o tipo-2 diabetes1. Enquanto as células beta são os produtores de insulina em ilhotas pancreáticas, a comunicação entre as células beta e as células não beta desempenha um papel crítico na regulação da secreção de insulina2. Além disso, a disregulação da secreção de glucagon contribui para a hiperglicemia no diabetes3. Assim, há um forte interesse em modular a expressão gênica de células dentro de ilhotas pancreáticas para abordar o mecanismo por trás do desenvolvimento da disfunção de ilhotas no diabetes. Uma variedade de aproximações que incluem ratos transgênicas está disponível para modular a expressão do gene de Islets do rato. Entretanto, as ilhotas humanas e do rato mostram a inervação distinta, a distribuição da pilha, a relação de beta às pilhas alfa, e a resposta aos secretagogos4. Portanto, a avaliação direta da função gênica em ilhotas humanas é extremamente importante para a compreensão da fisiopatologia das ilhotas pancreáticas humanas.
O vetor adenoviral é o vetor viral mais utilizado para transduce ilhotas pancreáticas in vitro devido à alta eficiência de transdução em células não-divisoras. No entanto, o adenovírus não penetra no núcleo das ilhotas de forma eficiente, especialmente nas ilhotas humanas5, e é citotóxica em altas doses6. Comparativamente, o vetor lentivirais é menos citotóxica e entrega genes exógenos permanentemente no cromossoma de pilhas borne-mitotic, fazendo lhe um veículo extensamente testado para a terapia do gene7. Entretanto, a capacidade do Lentivirus de penetrar o núcleo de ilhotas humanas intactas é limitada igualmente, assim exigindo a dispersão parcial pela digestão enzimática para aumentar a eficiência da transdução8. A ressalva com a dispersão de ilhotas humanas intactas é a interrupção da comunicação célula-célula e célula-matriz, que compromete a regulação dinâmica da secreção de insulina crítica para a manutenção da homeostase da glicose em seres humanos9. Assim, tem sido desafiador avaliar o impacto da modulação gênica na regulação dinâmica da função de ilhotas em um modelo de Ilhéus humanos.
Soube-se que as pilhas dispersadas do Islet das ilhotas humanas e do roedor reagregam autonomamente em Islet-como as estruturas chamadas “pseudoislets”. Pseudoislets mostra a distribuição beta e non-beta da pilha similar às ilhotas nativas10,11. Adicionalmente, após a cultura a longo prazo, as ilhotas nativas perdem progressivamente a secreção robusta de insulina de primeira fase5,10,11,12. No entanto, as pseudoilhotas demonstraram melhor preservação da secreção de insulina de primeira fase em resposta à glicose em comparação com as ilhotas nativas após o mesmo período de cultura5. Além de ter melhor preservação da secreção de insulina, a reagregação controlada por tamanho de células de Illet humanas em placas de fixação baixas11 fornece uma janela de oportunidade para introduzir vetores de Lentivirus antes de sua reagregação em pseudoislets. Diversos estudos demonstraram a utilidade dos pseudoislets combinados com o transdução mediada lentivirais. Caton et al.13 relataram que a introdução da proteína verde fluorescente (GFP) expressando Lentivirus teve pouco efeito sobre a secreção de insulina, obtendo expressão homogênea de GFP em pseudoislets de ratos em comparação com o controle não infectado. Eles também demonstraram o efeito específico de diferentes connexinas na secreção de insulina por sobreexpressar as connexinas 32, 36 e 43 via Lentivirus13. Os pseudoislets humanos preparados com uma placa de acessório ultra-baixa disponível comercialmente de 96-well demonstraram que o superexpressão lentiviral-negociado do fator SIX3 da transcrição melhora o secretion da insulina avaliado pela incubação estática14. Recentemente, os pseudoislets humanos preparados com uma placa ultra-baixa do acessório 96-well foram usados para downregulam o glucokinase através do RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) como uma prova do princípio para mostrar que a secreção glucose-estimulada do insulin é reduzida, quando A secreção de insulina estimulada por KCl foi preservada5. O estudo igualmente demonstrou que os pseudoislets humanos são similares às ilhotas nativas na expressão de gene e nos perfis secretora, suportando mais a utilidade de pseudoislets humanos para dissecar a regulação da função de ilhotas5. Embora o perifusion não fosse executado, uma placa geneticamente modificados da cultura do de micropoços que se tornasse recentemente disponível comercialmente, foi relatada igualmente para ser compatível para o transdução lentivirais e produziu os pseudoislets humanos que exibiram a insulina excelente secreção in vitro e in vivo após o transplante11. Coletivamente, a formação de pseudoislet humana combinada com a transdução lentivirais é uma abordagem simples e eficiente para investigar a fisiopatologia da ilhotas humana, proporcionando uma valiosa ferramenta para realizar estudos mecanísticos em ilhotas humanas.
No relatório atual, um protocolo para dar forma a pseudoislets humanos transou com o Lentivirus usando duas plataformas comercialmente disponíveis, uma placa ultra-baixa do acessório 96-well e uma placa da cultura do de micropoços são apresentadas. Ambos conseguem a modulação eficiente da expressão gênica e criam pseudoislets humanos que são compatíveis para avaliações a jusante, incluindo incubação estática e perifusão.
Aqui, um protocolo detalhado para gerar pseudoislets humanos que são transviados pelo Lentivirus usando uma placa de acessório ultra-baixa 96-well ou uma placa da cultura do de micropoços é apresentado. Os pseudoislets foram relatados para demonstrar a morfologia e as funções secretora similares às ilhotas humanas nativas e podem ser cultivados por o tempo prolongado in vitro5,11,12. Ao contrário das ilhotas humanas nati…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos institutos nacionais de saúde para Y.I. (R01-DK090490) e American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. e Y.I. são apoiados pela ordem fraterna do centro de pesquisa de diabetes Eagles. O A.B. é apoiado por um subsídio de formação nacional dos institutos de saúde (T32NS45549). Os autores utilizaram ilhotas pancreáticas humanas fornecidas pelo programa integrado de distribuição de ilhotas (IIDP), financiado pela NIDDK, na cidade da esperança (2UC4DK098085).
Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |