Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

La perdita di massa funzionale delle cellule beta è la patologia centrale sia per il diabete di tipo 1 che per il diabete di tipo 2¹. Mentre le cellule beta sono i produttori di insulina in isole pancreatiche, la comunicazione tra le cellule beta e le cellule non beta svolge un ruolo critico nella regolazione della secrezione di insulina². Inoltre, la disregolazione della secrezione glucagone contribuisce all’iperglicemia nel diabete³. Quindi, c’è un forte interesse a modulare l’espressione genica delle cellule all’interno delle isole pancreatiche per affrontare il meccanismo alla base dello sviluppo della disfunzione delle isole nel diabete. Sono disponibili una varietà di approcci, tra cui i topi transgenici, per modulare l’espressione genica delle isole del topo. Tuttavia, gli isolotti umani e murini mostrano l’innervazione distinta, la distribuzione cellulare, il rapporto tra le cellule beta e alfa e la risposta a secretagoghi⁴. Pertanto, la valutazione diretta della funzione genica nelle isole umane è estremamente importante per comprendere la fisiopatologia delle isole pancreatiche umane.

Il vettore adenovirale è il vettore virale più utilizzato per trasdurare le isole pancreatiche in vitro a causa dell’elevata efficienza della trasduzione nelle cellule non dividendo. Tuttavia, l’adenovirus non penetra nel nucleo delle isole in modo efficiente, soprattutto nelle isole umane⁵, ed è citotossico a dosi elevate⁶. Comparativamente, il vettore lentivirale è meno citotossico e fornisce geni esogeni permanentemente nel cromosoma delle cellule post-mitotiche, rendendolo un veicolo ampiamente testato per la terapia genica⁷. Tuttavia, anche la capacità del lentivirus di penetrare nel nucleo delle isole umane intatte è limitata, richiedendo così una dispersione parziale per digestione ezimatica per aumentare l’efficienza della trasduzione⁸. L’avvertenza con la dispersione di isolotti umani intatti è l’interruzione della comunicazione cellulare-cellula e cellula-matrice, che compromette la regolazione dinamica della secrezione di insulina critica per il mantenimento dell’omeostasi del glucosio negli esseri umani⁹. Pertanto, è stato difficile valutare l’impatto della modulazione genica sulla regolazione dinamica della funzione delle isole in un modello di isole umane.

È noto che le cellule di isole disperse provenienti da isole umane e roditori si reaggregano autonomamente in strutture simili a isole chiamate “pseudoislets”. Gli pseudoislets mostrano la distribuzione di celle beta e non beta simile alle islet native^10,11. Inoltre, dopo la cultura a lungo termine, le isole native perdono progressivamente robusta secrezione di insulina in prima fase^5,10,11,12. Tuttavia, gli pseudoislets hanno dimostrato una migliore conservazione della secrezione di insulina della prima fase in risposta al glucosio rispetto alle isole native dopo lo stesso periodo di coltura⁵. Oltre ad avere una migliore conservazione della secrezione di insulina, la riaggregazione a dimensione delle cellule dell’isolotto umano in piastre a basso attaccamento¹¹ fornisce una finestra di opportunità per introdurre vettori di lentivirus prima della loro riaggregazione in pseudoislets. Diversi studi hanno dimostrato l’utilità di pseudoislets combinati con la trasduzione mediata lentivirale. Caton et al.¹³ ha riferito che l’introduzione della proteina fluorescente verde (GFP) che esprime lentivirus ha avuto poco effetto sulla secrezione di insulina, ottenendo al contempo un’espressione omogenea della GFP nelle pseudoislets di ratto rispetto al controllo non infetto. Hanno anche dimostrato l’effetto specifico di diverse connessine sulla secrezione di insulina sovraesprimendo connexins 32, 36 e 43 tramite lentivirus¹³. Gli pseudoislets umani preparati con una piastra di fissaggio ultra-bassa disponibile in commercio hanno dimostrato che la sovraespressione mediata di lentivirale del fattore di trascrizione SIX3 migliora la secrezione dell’insulina valutata dall’incubazione statica¹⁴. Recentemente, sono stati utilizzati pseudoislets umani preparati con una piastra di fissaggio ultra-bassa di 96 pozzetti per ridurre la glucokinasi tramite RNA di forcina corta lentivirale (shRNA) come prova di principio per dimostrare che la secrezione di insulina stimolata dal glucosio è ridotta, mentre La secrezione di insulina stimolata da KCl è stata conservata⁵. Lo studio ha anche dimostrato che gli pseudoislets umani sono simili agli isolotti nativi nell’espressione genica e nei profili secretoria, sostenendo ulteriormente l’utilità degli pseudoislets umani per sezionare la regolazione della funzione islet⁵. Anche se la perifusione non è stata eseguita, una piastra di coltura di microwell bioingegnerizzata che recentemente è diventata disponibile in commercio, è stata anche segnalata per essere compatibile per la trasduzione lentivirale e ha prodotto pseudoislets umane che presentano eccellenti insulina secrezione in vitro e in vivo dopo il trapianto¹¹. Collettivamente, la formazione dello pseudoislet umano combinata con la trasduzione lentivirale è un approccio semplice ed efficiente per studiare la fisiopatologia delle isole umane, fornendo uno strumento prezioso per eseguire studi meccanicistici nelle isole umane.

Nella relazione attuale, viene presentato un protocollo per formare pseudoislets umane tradusse con lentivirus utilizzando due piattaforme disponibili in commercio, una piastra di fissaggio ultra-bassa 96-pozzetto e una piastra di coltura microwell. Entrambi ottengono un’efficace modulazione dell’espressione genica e creano pseudoislets umane compatibili per le valutazioni a valle, tra cui l’incubazione statica e la perifusione.