低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

機能性β細胞塊の喪失は、1型および2型糖尿病1の両方の中心病理である。β細胞は膵島におけるインスリンの産生であるが、β細胞と非β細胞との間の通信は、インスリン分泌2の調節において重要な役割を果たす。また、グルカゴン分泌の調節不自由は^糖尿病3における高血糖に寄与する。したがって、膵島内の細胞の遺伝子発現を調節し、糖尿病における膵島機能障害の発症のメカニズムに対処することに強い関心がある。トランスジェニックマウスを含む様々なアプローチは、マウス島の遺伝子発現を調節するために利用可能である。しかしながら、ヒトおよびマウスの島は、明確な内向性、細胞分布、β対α細胞の比率、および分泌^物4に対する応答を示す。したがって、ヒト膵島における遺伝子機能の直接評価は、ヒト膵島の病態生理学を理解するために非常に重要である。

アデノウイルスベクターは、非分裂細胞におけるトランスダクションの高効率に起因するインビトロで膵島をトランスデュースするために最も広く使用されているウイルスベクターである。しかしながら、アデノウイルスは、特にヒト島5において効率的に島のコアに浸透せず、高用量6で細胞傷害性である。比較的、レンチウイルスベクターは細胞傷害性が低く、外因性遺伝子をポスト有人細胞の染色体に永久に産生し、遺伝子治療7の広くテストされた手段となる。しかしながら、無傷のヒト島のコアに侵入するレンチウイルスの能力も制限され、従って経誘導効率を高めるために酵素消化による部分的な分散を必要とする8。無傷のヒト島の分散に伴う注意点は、細胞および細胞マトリックス通信の中断であり、これはヒト^におけるグルコース恒常性の維持に不可欠なインスリン分泌の動的調節を損なう9。したがって、ヒト島のモデルにおける島機能の動的調節に対する遺伝子変調の影響を評価することは困難であった。

ヒトとげっ歯類の島から分散した島細胞が「擬似島」と呼ばれる島様構造に自律的に再凝集させることが知られている。擬似島は、原住民の島10、11と同様のβおよび非β細胞分布を示す。さらに、長期培養後、天然島は徐々に堅牢な第1相インスリン分泌5、10、11、12を失う。しかしながら、擬似島は、同じ培養期間5の後に天然島と比較してグルコースに応答して第1相インスリン分泌のより良い保存を実証した。インスリン分泌のより良い保存に加えて、低アタッチメント^{プレート11}におけるヒトイヌレット細胞のサイズ制御再凝集は、その再凝集前にレンチウイルスベクターを導入する機会の窓を提供する。擬似島。いくつかの研究は、レンチウイルス媒介伝達伝達と組み合わせた擬似島の有用性を実証している。Caton et al. al. は13,レンチウイルスを発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)の導入は、非感染対照と比較してラット擬似性のGFPの均質な発現を達成しながら、インスリン分泌にほとんど影響を及ぼさないことを報告した。彼らはまた、レンチ^{ウイルス13}を介してコネキシン32、36、および43を過剰発現することにより、インスリン分泌に対する異なるコネキシンの特定の効果を実証した。市販の96ウェル超低アタッチメントプレートを用いて調製されたヒト擬似酵素は、転写因子SIX3のレンチウイルス媒介過剰発現が静的インキュベーション14によって評価されるインスリン分泌を改善することを実証した。最近では、96ウェルの超低アタッチメントプレートで調製したヒト擬似糸は、グルキナーゼをレンチウイルスショートヘアピンRNA(shRNA)を介して下方調整し、グルコース刺激インスリン分泌が減少することを示す原理の証明として用いられた。KCl刺激インスリン分泌^は5を保存した。この研究はまた、ヒト擬似離島が遺伝子発現および分泌プロファイルにおける天然島に類似していることを実証し、さらに、島^機能5の調節を解剖するヒト擬似島の有用性を支持する。多灌合は行われなかったが、最近市販されたバイオエンジニアリングマイクロウェル培養プレートは、レンチウイルス伝達に適合すると報告され、優れたインスリンを発揮するヒト擬似性を産生した。移植後のインビトロとインビボでの分泌¹¹.集合的に、レンチウイルス伝達と組み合わせたヒト擬似スサイスレット形成は、ヒト島の病態生理学を調査するための簡単で効率的なアプローチであり、ヒト島における機械的研究を行うための貴重なツールを提供する。

本報告では、市販の2つのプラットフォームを用いてレンチウイルスで誘導されたヒト擬似性を形成するプロトコル、96ウェル超低アタッチメントプレートおよびマイクロウェル培養プレートが提示される。どちらも遺伝子発現の効率的な変調を実現し、静的インキュベーションやペリフュージョンを含む下流評価に対応するヒト擬似液を作成します。