Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

La perte de masse cellulaire bêta fonctionnelle est la pathologie centrale pour le diabète de type 1 et de type 2¹. Alors que les cellules bêta sont les producteurs d’insuline dans les îlots pancréatiques, la communication entre les cellules bêta et les cellules non bêta joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline². En outre, la dysrégulation de la sécrétion de glucagon contribue à l’hyperglycémie dans le diabète³. Ainsi, il y a un grand intérêt à moduler l’expression génique des cellules dans les îlots pancréatiques pour aborder le mécanisme derrière le développement du dysfonctionnement d’îlots dans le diabète. Une variété d’approches comprenant des souris transgéniques sont disponibles pour moduler l’expression de gène des îlots de souris. Cependant, les îlots humains et de souris montrent l’innervation distincte, la distribution cellulaire, le rapport de bêta aux cellules alpha, et la réponse aux sécréagogues⁴. Par conséquent, l’évaluation directe de la fonction génique dans les îlots humains est extrêmement importante pour comprendre la pathophysiologie des îlots pancréatiques humains.

Le vecteur adénoviral est le vecteur viral le plus largement utilisé pour transduire les îlots pancréatiques in vitro en raison de la forte efficacité de la transduction dans les cellules non-divisantes. Cependant, l’adénovirus ne pénètre pas efficacement au cœur des îlots, en particulier dans les îlots humains⁵, et est cytotoxique à fortes doses⁶. En comparaison, le vecteur lentiviral est moins cytotoxique et délivre des gènes exogènes de façon permanente dans le chromosome des cellules post-mitotiques, ce qui en fait un véhicule largement testé pour la thérapie génique⁷. Cependant, la capacité du lentivirus à pénétrer le noyau des îlots humains intacts est également limitée, nécessitant ainsi une dispersion partielle par digestion enzymatique pour augmenter l’efficacité de la transduction⁸. La mise en garde avec la dispersion des îlots humains intacts est l’interruption de la communication cellule-cellule et cellule-matrice,qui compromet la régulation dynamique de la sécrétion d’insuline critique pour le maintien de l’homéostasie de glucose chez l’homme 9. Ainsi, il a été difficile d’évaluer l’impact de la modulation des gènes sur la régulation dynamique de la fonction des îlots dans un modèle d’îlots humains.

On sait que les cellules des îlots dispersés des îlots humains et des rongeurs se réagroupent de façon autonome en structures semblables à des îlots appelées « pseudoislets ». Pseudoislets montrent la distribution des cellules bêta et non bêta similaire aux îlots indigènes^10,11. En outre, après la culture à long terme, les îlots indigènes perdent progressivement la sécrétion robuste d’insuline de première phase^5,10,11,12. Pourtant, les pseudoislets ont démontré une meilleure conservation de la sécrétion d’insuline de première phase en réponse au glucose comparé aux îlots indigènes après la même période de culture^5. En plus d’avoir une meilleure conservation de la sécrétion d’insuline, la réagrégation contrôlée par la taille des cellules des frayons humains dans les plaques à faible attachement¹¹ offre une fenêtre d’opportunité pour introduire des vecteurs de lentivirus avant leur réaggrégement dans pseudoislets. Plusieurs études ont démontré l’utilité des pseudoislets combinés à la transduction médiée par lentiviral. Caton et coll.¹³ ont signalé que l’introduction de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant le lentivirus avait peu d’effet sur la sécrétion d’insuline tout en atteignant l’expression homogène du GFP dans les pseudoislets de rat comparés au contrôle non-infecté. Ils ont également démontré l’effet spécifique de différentes connexines sur la sécrétion d’insuline en surexprimant connexins 32, 36, et 43 par l’intermédiaire de lentivirus^13. Les pseudoislets humains préparés avec une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits disponible dans le commerce ont démontré que la surexpression par le facteur de transcription SIX3 améliore la sécrétion d’insuline évaluée par incubation statique¹⁴. Récemment, des pseudoislets humains préparés avec une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits ont été utilisés pour réguler la glucokinase par l’intermédiaire de l’ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (arsh) comme preuve de principe pour montrer que la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose est réduite, tandis que La sécrétion d’insuline stimulée par KCl a été préservée⁵. L’étude a également démontré que les pseudoislets humains sont semblables aux îlots indigènes dans l’expression des gènes et les profils sécréteurs, soutenant davantage l’utilité des pseudoislets humains pour disséquer la régulation de la fonction d’îlots⁵. Bien que la perifusion n’ait pas été effectuée, une plaque de culture de micropuits bioengineered qui est récemment devenue commercialement disponible, a été également rapportée pour être compatible pour la transduction lentivirale et a produit des pseudoislets humains qui ont exhibé l’excellente insuline sécrétion in vitro et in vivo après la transplantation¹¹. Collectivement, la formation de pseudoislet humain combinée à la transduction lentivirale est une approche simple et efficace pour étudier la pathophysiologie humaine d’îlots, fournissant un outil valable pour effectuer des études mécanistes dans les îlots humains.

Dans le rapport actuel, un protocole pour former des pseudoislets humains transduiré s’est transduifait avec le lentivirus à l’aide de deux plates-formes disponibles dans le commerce, une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits et une plaque de culture de micropuits est présentée. Les deux permettent de modulation efficace de l’expression génique et de créer des pseudoislets humains compatibles pour les évaluations en aval, y compris l’incubation statique et la perifusion.