פרוטוקול כדי ליצור גנים שונה האדם מדומה מפוזרים תאים איון האדם התפזרו על ידי וירוס לנשיאת RNA קצר (מרין) מוצג. פרוטוקול זה מנצל את כלי האנזים והתרבות הזמינים, ניתן לבצע בקלות, והוא מייצר מדומה מבחינה גנטית מדומה המתאים ללימודים פונקציונליים ומורפולוגיים.
כלים גנטיים שונים זמינים לווסת גנים באיים הלבלב של מכרסמים כדי לנתח פונקציה של גנים איון למחקר סוכרת. עם זאת, הנתונים שהושגו מתוך איולי מכרסמים הם לעתים קרובות לא לשכפל במלואו או ישים לאיים האנושיים בשל הבדלים ידועים במבנה איון ותפקוד בין המינים. כיום, טכניקות הזמינות כדי לתמרן ביטוי הגנים של האיים האנושיים מוגבלים מאוד. מבוא של הטרנסגנים אל איונים שלמים על ידי אדנווירוס, פלסמיד, ו פורוזימטר לעתים קרובות סובל מיעילות נמוכה רעילות גבוהה. יעילות נמוכה היא בעייתית במיוחד במחקרים להוריד גנים באיונים שלמים, אשר דורשים יעילות גבוהה. ידוע כי התאים הפזורים בתוך הפיזור מחדש התפזרו בתרבות היוצרים הספרואידים שנקרא פסבדו. גודל מבוקר צבירה מחדש של תאים איון האדם יוצר מדומה כי לשמור על הפרשה דינמית בשלב הראשון אינסולין לאחר תרבות ממושכת ולספק חלון כדי להציג ביעילות את ה-RNA הקצר ויראלי (שרין) עם רעילות נמוכה. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירת הפסבדו האנושי לאחר התמרה ויראלית באמצעות שתי צלחות מסחריות הזמינות בשני הלוחות מתוארות. הפרוטוקול ניתן לבצע בקלות ומאפשר להוריד יעיל של גנים והערכה של דינמיות של הפרשת אינסולין באמצעות תאים איון האדם. כך, מדומה אנושי עם אפנון גנטית מתווכת בתיווך לספק מודל רב עוצמה ורב תכליתי כדי להעריך את תפקוד הגנים בתוך תאי איון האדם.
ההפסד של מסה תא ביתא פונקציונלי הוא הפתולוגיה המרכזית עבור שני סוג 1 וסוכרת סוג 21. בעוד תאי ביתא הם המפיקים של האינסולין באיים הלבלב, תקשורת בין תאי ביתא ותאים שאינם ביתא ממלא תפקיד קריטי בוויסות הפרשת האינסולין2. בנוסף, דיסתקנה של הפרשת גלוקגון תורמת להירגליקמיה בסוכרת3. כך, יש עניין חזק לווסת את הביטוי הגנטי של תאים בתוך איונים הלבלב כדי לטפל במנגנון מאחורי התפתחות של התפקוד של איון בסוכרת. מגוון רחב של גישות כולל עכברים טרנסגניים זמינים כדי לווסת את הביטוי הגנטי של איונים של העכבר. עם זאת, איונים אנושיים ועכברים להראות אינבציה שונה, התפלגות התא, היחס של ביתא לתאי אלפא, ואת התגובה הסוד4. לכן, הערכה ישירה של הפונקציה גנטי באיים האנושיים הוא חשוב מאוד להבנת הפתופסולוגיה של איולי הלבלב האנושי.
וקטור אדנונגיפי הוא וקטור ויראלי הנפוץ ביותר כדי לשנות את איולי הלבלב בחוץ בגלל היעילות הגבוהה של התמרה בתאים שאינם מפרידים. עם זאת, אדנווירוס לא לחדור לליבה של איונים ביעילות, במיוחד באיים האנושיים5, ו ציטוטוקסינים במינון גבוה6. יחסית, וקטור לנטינגיל הוא פחות ציטוטוקסיני ומספק גנים אקסוגניים לצמיתות לתוך כרומוזום של התאים post-mitotic, מה שהופך אותו רכב נבדק נרחב עבור טיפול גנטי7. עם זאת, את היכולת של הנגיף כדי לחדור את הליבה של איים אנושיים שלמים הוא גם מוגבל, ובכך דורשים פיזור חלקי על ידי העיכול אנזימטי כדי להגביר את יעילות התמרה8. האזהרה עם הפיזור של איים אנושיים שלמים היא ההפרעה של תא תא ותקשורת תא מטריקס, אשר מתפשר על הרגולציה הדינמית של הפרשת אינסולין קריטית לתחזוקת הומאוסטזיס גלוקוז בבני אדם9. לכן, זה כבר מאתגר להעריך את ההשפעה של אפנון גנטי על הרגולציה הדינמית של הפונקציה איון במודל של איונים אנושיים.
זה כבר ידוע כי מפוזרים תאים איון מ בני אדם מכרסמים באופן עצמאי מחדש לתוך מבנים כמו איון שנקרא “פסבדו”. פסאודו איים להראות ביתא ולא התפלגות תא ביתא דומה הילידים10,11. בנוסף, לאחר תרבות ארוכת טווח, האיים המקומיים מאבדים בהדרגה את הפרשת האינסולין הראשונית בשלב הראשון5,10,11,12. עם זאת, פסבדו-מוח הפגינו שימור טוב יותר של הפרשת האינסולין בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לעומת איונים מקומיים לאחר אותה תקופה של תרבות5. בנוסף לשימור טוב יותר של הפרשת אינסולין, לצבור מבוקר גודל של תאים איון האדם בלוחות מצורף נמוך11 מספק חלון של הזדמנות להציג וקטורים וירוס לפני הצבירה שלהם לתוך . מאוד מאיים מספר מחקרים הוכיחו את כלי השירות של הפסבדו בשילוב עם התמרה מתווכת. Caton ואח ‘13 דיווחו כי המבוא של חלבון פלורסנט ירוק (gfp) הביעה הבעה וירוס היתה השפעה קטנה על הפרשת אינסולין תוך השגת ביטוי הומוגנית של gfp ב מדומה לחולדה לעומת שליטה לא נגוע. הם גם הפגינו את ההשפעה הספציפית של connexins שונים על הפרשת אינסולין על ידי הבעת היתר connexins 32, 36, ו 43 באמצעות הנגיף13. מדומה האנושי הכין עם מסחרית זמין 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת הראו כי הבעה ויראלי-מתווכת הביטוי של שעתוק גורם SIX3 משפר את הפרשת האינסולין המוערך על ידי דגירה סטטי14. לאחרונה, מדומה של האדם שהוכן בלוח ההחזקות ה96-והטוב אולטרה-נמוך, שימשו לצמצום השימוש בגלוקינאז דרך רנ א קצר ויראלי (שרין) כהוכחה לעיקרון כדי להראות כי הפרשת אינסולין מגורה מופחתת, בעוד הפרשת אינסולין מאולצת נשמרה ב-5. המחקר הראה גם כי מדומה האנושי דומים לאיונים מקומיים בביטוי גנים ופרופילי הפרשה, תמיכה נוספת של השירות של פסאודו האדם כדי לנתח את הרגולציה של הפונקציה איון5. למרות הפריזיה לא בוצעה, צלחת תרבות המיקרוגל ביולוגי שלאחרונה הפך להיות זמין מסחרית, דווח גם להיות תואם התמרה ויראלית והפיק מדומה ומיוצר האנושי הציג אינסולין מעולה הפרשה במבחנה ובvivo לאחר השתלת11. באופן קולקטיבי, היווצרות מדומה האדם בשילוב עם התמרה ויראלית היא גישה פשוטה ויעילה כדי לחקור את האי האנושי פתופסולוגיה, מתן כלי רב ערך לבצע מחקרים מכניסטיים באיונים אנושיים.
בדוח הנוכחי, פרוטוקול ליצירת מגוון מדומה של האדם עם וירוס באמצעות שתי פלטפורמות זמינות מסחרית, a 96-היטב אולטרה מצורף לוחית החיבור ולוח תרבות המיקרוגל מוצג. שניהם להשיג אפנון יעיל של ביטוי גנים וליצור מדומה אנושי התואמים הערכות במורד הזרם כולל דגירה סטטי הפריזיה.
כאן, פרוטוקול מפורט כדי ליצור מדומה האנושי כי הם התמרה על ידי וירוס באמצעות מ96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת או לוחית התרבות מוצג. פסאודו איים דיווחו להפגין מורפולוגיה ופונקציות הפרשה דומה האיים האנושיים הילידים יכולים להיות מתורבתים לזמן ממושך בתוך מבחנה5,11…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת כספית על ידי מכוני הבריאות הלאומיים לY.I. (R01-DK090490) והאגודה האמריקנית לסוכרת Y.I. (1-17-IBS-132). דביק ja ו-Y.I. נתמכים על ידי המרכז לחקר הסוכרת של הנשרים מסדר אחווה. א יהושע נתמך על ידי המכון הלאומי של מענק הכשרה בריאות (T32NS45549). מחברים מנוצל האדם הלבלב איונים שסופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון NIDDK במימון (IIDP) בעיר של תקווה (2UC4DK098085).
Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |