קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר
Summary
הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4+ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.
Abstract
מתוארים הוא פשוט, באופן מתורבת, לדילול צבען שיטה מבוססת למדידת אנטיגן ספציפי CD4+ T התפשטות התא של דם היקפי בתאי מונפינקה (PBMCs). התפתחות יציבה, שאינם רעילים, צבעי פלורסנט כגון carboxyfluorescmidyl באסטר (CFSE) מאפשר נדיר, אנטיגן ספציפיים תאים T להיות נבדל מעוברי אורח על ידי צמצום בצביעת פלורסנט, כפי שזוהה על ידי הזרמת cy try. שיטה זו כוללת את היתרונות הבאים על פני גישות חלופיות: (i) היא רגישה מאוד לתאי T בתדר נמוך, (ii) לא ניתן לנתח את האנטיגן או האפיפי, (iii) הפנוטיפים של התאים המגיבים ניתנים לניתוח, ו-(iv) קיימא, תגובה ניתן למיין ולהשתמש בתאים לצורך ניתוח נוסף, כגון שכפול תא T.
Introduction
היכולת לזהות וללמוד אנטיגן מסוים תאים T חשוב במחקרים של חסינות התא בתיווך. עם זאת, עושה זאת היא מאתגרת במיוחד עבור התגובות autoantigen ספציפי CD4+ T-cell תשובות, אשר חלשים מאוד קשה לזהות. שיטה נפוצה המשמשת לזיהוי של הפצת לימפוציטים ספציפיים אנטיגן היא [3H]-thymidine, שהוא נוקלאוטיד הקרינה משולבים ל-DNA של תאים מתרבים. למרות העובדה [3h]-thymidine יכול לזהות סינתזה dna, שיטה זו היא מידה עקיפה של החטיבה התא, משום סינתזה dna יכול ליזום עצמאית של מיטוזה (כלומר, במהלך שכפול גנים ו אפופטוזיס1). בעיה זו היא מורכבת על ידי העובדה אנטיגן ספציפי התפשטות של תאים יכול לגרום אפופטוזיס ניכרת2, המוביל להערכת יתר פוטנציאלי של התפשטות אנטיגן ספציפי. יתר על כן, השיטה [3h]-thymidine אינו מספק מידע פנוטימית עבור לימפוציטים מתרבים, כגון CD4+ או CD8+ שושלת היוחסין ב pbmcs מגורה עם פפטידים העברה אנטיגנית.
בשנת 2003, פרסמנו את השיטה הראשונה לדילול הצבע באמצעות cfse, שנקרא שיטת ההפצה המבוססת על cfse3,4. CFSE הוא צבע פלורסנט הנקשר באופן בלתי נשכח חלבונים תאיים על ידי יצירת קשר קוולנטי לשקעי ליזין תאיים. מאז החלבונים CFSE-התווית מחולקים באופן שווה בין תאים ביתי3, תאים אשר מחולקים יכול להיות נבדל מתאים מאוחדת על ידי הזרמת cy, אשר גם מאפשר פנוטיפים כמותיים של אוכלוסיות לימפוציטים. אכן, מספר מחלקות התא עבר מזמן של CFSE-צביעת ניתן למדוד במידה מסוימת5. לאחרונה, צבעים דומים רבים כמו CellTrace צבע ויולט התפשטות (VPD) ו-ציטוtrack צבען פותחו, אשר פועלים באופן דומה6. פרוטוקול זה מתמקד CFSE, אבל העקרונות חלים באופן שווה על צבעים אחרים הקשורים.
פפטיד-MHC מכתים כתמים היא שיטה נפוצה לגילוי ושיבוט של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. זוהי שיטה מבוססת היטב7,8,9,10; עם זאת, שיבוט מבוסס הטטרמר דורש ידע קיים של ההגבלה האפירופה/MHC וכל אפירופה דורש את הטטרזה11שלו, אשר מגביל את היקף הגילוי והשכפול של תאי T ספציפיים לספרות. התפשטות CFSE מבוססי ניתן להשתמש עם פפטידים, חלבונים, או lysates תא. הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט ויציב, והתאים המגיבים CD4+ T יכולים להיות ממוינים לשימוש בתוך האפיון התפקודי והביוכימיים במורד הזרם12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפשטות CFSE מבוססת היא שיטה פשוטה ואיתנה לזיהוי ולספירה של תאים אנושיים ספציפיים CD4+ T. זה כבר הוכיחה בעבר כי באמצעות ריכוז אופטימלי של CFSE חיוני עבור תוצאות אופטימליות4. יותר מדי CFSE abrogates התפשטות, בעוד מעט מדי אינו מאפשר לתאים מחולקים ומחולקת להיות מכובד. לעומת זאת, ריכוזים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי: הקרן לחקר סוכרת נעורים [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (ש. מ.). המועצה הלאומית לחקר הבריאות והרפואה (NHMRC GNT123586) (ש. מ.), סוכרת המילניום של אוסטרליה מחקר ביחסי אמון (Y17M1-מאן), תוכנית תמיכה בתשתיות תפעוליות של הממשלה הויקטוריאנית (ש. מ., א. ד., א. ט.), ו-NHMRC מלגת לתארים מתקדמים APP1094337 ו-JDRF PhD מלגה למעלה (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
