Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Summary
Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4+ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.
Abstract
Beschreven is een eenvoudige, in vitro, kleurstof verdunnings methode voor het meten van antigeen-specifieke CD4+ T celproliferatie in menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De ontwikkeling van stabiele, niet-toxische, fluorescerende kleurstoffen zoals carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) maakt het mogelijk zeldzame, antigeen-specifieke T-cellen te onderscheiden van omstanders door vermindering in fluorescerende kleuring, zoals gedetecteerd door flow cytometrie. Deze methode heeft de volgende voordelen ten opzichte van alternatieve benaderingen: (i) het is zeer gevoelig voor laagfrequente T-cellen, (II) geen kennis van het antigeen of epitoop is vereist, III) het fenotype van de reagerende cellen kan worden geanalyseerd en (IV) levensvatbaar, cellen kunnen worden gesorteerd en gebruikt voor verdere analyse, zoals T-cellen klonen.
Introduction
De mogelijkheid om antigeen-specifieke T-cellen te detecteren en te bestuderen is belangrijk in onderzoeken naar door cellen gemedieerde immuniteit. Echter, dit is vooral een uitdaging voor autoantigen-specifieke CD4+ T-cel reacties, die zeer zwak en moeilijk te detecteren zijn. Een veelgebruikte methode voor de detectie van antigeen-specifieke lymfocyten proliferatie is [3H]-thymidine, een van nucleotide dat is opgenomen in het DNA van prolifererende cellen. Hoewel de [3H]-thymidine-test DNA-synthese kan detecteren, is deze methode een indirecte maatstaf voor celdeling, omdat DNA-synthese onafhankelijk van mitose kan starten (d.w.z. tijdens genduplicatie en apoptosis1). Dit probleem wordt verergerd door het feit dat antigeen-specifieke proliferatie van cellen kan resulteren in aanzienlijke apoptosis2, wat leidt tot een mogelijke overschatting van antigeen-specifieke proliferatie. Bovendien levert de methode [3H]-thymidine geen fenotypische informatie voor prolifererende lymfocyten, zoals CD4+ of CD8+ Lineage proliferatie in PBMCs, gestimuleerd met antigene peptiden.
In 2003 publiceerden we de eerste kleurstof verdunnings test met behulp van CFSE, genaamd de op CFSE gebaseerde proliferatie test3,4. CFSE is een fluorescerende kleurstof die stabiel bindt aan intracellulaire eiwitten door een covalente binding te vormen aan intracellulaire lysine residuen. Aangezien CFSE-gelabelde eiwitten gelijkelijk worden verdeeld onder dochtercellen3, kunnen cellen die zijn onderverdeeld worden onderscheiden van onverdeelde cellen door Flowcytometrie, wat ook de kwantitatieve fenotypering van lymfocyten populaties mogelijk maakt. Het aantal divisies dat een cel heeft ondergaan vanaf de tijd van de CFSE-kleuring kan worden gemeten tot op zekere hoogte5. Meer recentelijk zijn veel vergelijkbare kleurstoffen ontwikkeld, zoals CellTrace Violet proliferatie Dye (VPD) en CytoTrack Dye, die op dezelfde manier werken6. Dit protocol richt zich op CFSE, maar de principes gelden evenzeer voor andere verwante kleurstoffen.
Peptide-MHC tetrameer kleuring is een veelgebruikte methode voor het opsporen en klonen van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen. Dit is een goed opgezette methode7,8,9,10; het klonen op basis van tetrameer vereist echter bestaande kennis van de epitoop/MHC-beperking en elke epitoop vereist zijn eigen tetrameer11, die de reikwijdte van ontdekking en klonen van nieuwe epitoop-specifieke T-cellen beperkt. De op CFSE gebaseerde proliferatie kan worden gebruikt met peptiden, eiwitten of cellysaten. Het hier beschreven protocol is zowel eenvoudig als robuust, en de respons CD4+ T-cellen kunnen worden gesorteerd voor gebruik in downstream functionele en Biochemische karakterisering van de assays12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proliferatie op basis van CFSE is een eenvoudige en robuuste methode voor het opsporen en inventariseren van antigeen-specifieke humane CD4+ T-cellen. Het is al eerder aangetoond dat het gebruik van de optimale concentratie van CFSE essentieel is voor optimale resultaten4. Te veel CFSE abrogates proliferatie, terwijl te weinig staat niet toe dat verdeelde en onverdeelde cellen te onderscheiden. Daarentegen worden relatief hoge concentraties (5,0 μM) van CFSE gebruikt om gezuiverde Muri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door: de juveniele diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). De National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), operationeel infrastructuur ondersteuningsprogramma van de Victoriaanse overheid (S. M., A. D., E. T., M. S.) en NHMRC Postdoctorale studiebeurs APP1094337 en JDRF PhD top-up beurs (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
