Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4+ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.
Abstract
Beschrieben wird eine einfache, in vitro, auf Farbstoffen basierende Methode zur Messung der antigenspezifischen CD4+ T-Zellproliferation in mononukleären menschlichen Blutzellen (PBMCs). Die Entwicklung stabiler, ungiftiger Fluoreszenzfarbstoffe wie Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ermöglicht es, seltene, antigenspezifische T-Zellen von Umstehenden durch Verminderung der fluoreszierenden Färbung zu unterscheiden, wie sie durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Diese Methode hat gegenüber alternativen Ansätzen folgende Vorteile: (i) Sie ist sehr empfindlich gegenüber niederfrequenten T-Zellen, (ii) es ist keine Kenntnis des Antigens oder Epitops erforderlich, (iii) der Phänotyp der reagierenden Zellen kann analysiert werden, und (iv) lebensfähig, Zellen können sortiert und für weitere Analysen verwendet werden, z. B. t Zellklonen.
Introduction
Die Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen zu erkennen und zu untersuchen, ist in Studien zur zellvermittelten Immunität wichtig. Dies ist jedoch besonders anspruchsvoll für autoantigenspezifische CD4+ T-Zell-Antworten, die sehr schwach und schwer zu erkennen sind. Eine gängige Methode zum Nachweis der antigenspezifischen Lymphozytenproliferation ist [3H]-Thymidin, ein radioaktiv markiertes Nukleotid, das in die DNA von proliferierenden Zellen integriert ist. Obwohl der [3H]-Thymidin-Assay die DNA-Synthese erkennen kann, ist diese Methode ein indirektes Maß für die Zellteilung, da die DNA-Synthese unabhängig von Mitose initiieren kann (d. h. bei Genduplizierung und Apoptose1). Dieses Problem wird durch die Tatsache verschlimmert, dass antigenspezifische Proliferation von Zellen zu einer erheblichen Apoptose führen kann2, was zu einer potenziellen Überschätzung der antigenspezifischen Proliferation führt. Darüber hinaus liefert die [3H]-Thymidin-Methode keine phänotypischen Informationen für vermehrende Lymphozyten, wie CD4+ oder CD8+ Lineage Proliferation in PBMCs, die mit antigenen Peptiden stimuliert werden.
Im Jahr 2003 veröffentlichten wir den ersten Farbstoffverdünnungstest mit CFSE, dem CFSE-basierten Proliferationstest3,4. CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff, der stabil an intrazelluläre Proteine bindet, indem er eine kovalente Bindung an intrazelluläre Lysinrückstände bildet. Da CFSE-markierte Proteine gleichmäßig auf Tochterzellen3aufgeteilt sind, können Zellen, die sich geteilt haben, von ungeteilten Zellen durch Durchflusszytometrie unterschieden werden, was auch die quantitative Phänotypisierung von Lymphozytenpopulationen ermöglicht. Tatsächlich kann die Anzahl der Divisionen, die eine Zelle seit der Zeit der CFSE-Färbung durchgemacht hat, bis zu einem gewissen Gradgemessenwerden 5 . In jüngerer Zeit wurden viele ähnliche Farbstoffe wie CellTrace Violet Proliferationsfarbstoff (VPD) und CytoTrack Farbstoff entwickelt, die in ähnlicher Weise arbeiten6. Dieses Protokoll konzentriert sich auf CFSE, aber die Prinzipien gelten gleichermaßen für andere verwandte Farbstoffe.
Peptid-MHC-Tetramerfärbung ist eine weit verbreitete Methode zum Erkennen und Klonen von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen. Dies ist eine etablierte Methode7,8,9,10; Das Klonen auf Tetramerbasis erfordert jedoch vorhandene Kenntnisse der Epitop-/MHC-Beschränkung und jedes Epitop erfordert sein eigenes Tetramer11, das den Umfang der Entdeckung und des Klonens neuartiger Epitop-spezifischer T-Zellen begrenzt. Die CFSE-basierte Proliferation kann mit Peptiden, Proteinen oder Zelllysaten verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und robust, und die antwortenden CD4+ T-Zellen können für den Einsatz in nachgelagerten funktionellen und biochemischen Charakterisierungstests12,13sortiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE-basierte Proliferation ist eine einfache und robuste Methode zum Erkennen und Aufzählen von antigenspezifischen menschlichen CD4+ T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, dass die optimale Konzentration von CFSE für optimale Ergebnisse unerlässlich ist4. Zu viel CFSE hebt die Proliferation auf, während zu wenig nicht zulässt, dass geteilte und ungeteilte Zellen unterschieden werden. Im Gegensatz dazu werden relativ hohe CfSE-Konzentrationen (5,0 m) zur Kennzeichnung gereinigter mur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). The National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Operational Infrastructure Support Program of the Victorian Government (S. M., A. D., E. T., M. S.) und NHMRC Postgraduate Scholarship APP1094337 und JDRF PhD Top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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