Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein
Summary
É apresentado aqui um protocolo para medir proliferating pilhas de T CD4+ em resposta às proteínas antigénicas ou aos peptídeos usando a diluição da tintura. Este ensaio é particular sensível às pilhas de T antígeno-específicas raras e pode ser modificada para facilitar a clonagem de pilhas antígeno-específicas.
Abstract
Descrito é um método simples, in vitro, baseado na diluição da tintura para medir a proliferação antígeno-específica da pilha de T CD4+ em pilhas mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). O desenvolvimento de tinturas estáveis, não-tóxicas, fluorescentes tais como o éster do grufo do usando (CFSE) permite que as pilhas de T raras, antígeno-específicas sejam distinguidas dos transeunte pela diminuição na mancha fluorescente, como detectado pelo fluxo cytometry. Este método tem as seguintes vantagens sobre abordagens alternativas: (i) é muito sensível a células T de baixa frequência, (II) nenhum conhecimento do antígeno ou epítopo é necessária, (III) o fenótipo das células que respondem pode ser analisado, e (IV) viável, respondendo células podem ser classificadas e usadas para análise posterior, como a clonagem de células T.
Introduction
A capacidade de detectar e estudar células T antígeno-específicas é importante em estudos de imunidade mediada por células. No entanto, isso é particularmente desafiador para as respostas de células T CD4+ específicas do autoantígeno, que são muito fracas e difíceis de detectar. Um método comum usado para a deteção da proliferação antígeno-específica do linfócito é [3H]-thymidine, que é um nucleotide radiolabeled incorporado no ADN de pilhas proliferating. Embora o ensaio de [3h]-thymidine possa detectar a síntese do ADN, este método é uma medida indireta da divisão da pilha, porque a síntese do ADN pode iniciar independentemente da mitose (isto é, durante a duplicação do gene e o apoptose1). Esta edição é agravada pelo fato de que a proliferação antígeno-específica das pilhas pode conduzir ao apoptose considerável2, conduzindo ao overestimato potencial da proliferação antígeno-específica. Além disso, o método de [3H]-timidina não fornece informações fenotípicas para linfócitos proliferantes, como a proliferação de linhagem CD4+ ou CD8+ em PBMCs estimulados com peptídeos antigênicos.
Em 2003, publicamos o primeiro ensaio de diluição de corante utilizando o CFSE, denominado ensaio de proliferação baseado em CFSE3,4. O CFSE é um corante fluorescente que se liga de forma estável a proteínas intracelulares, formando uma ligação covalente aos resíduos de lisina intracelular. Desde que as proteínas CFSE-etiquetadas são divididas ingualmente entre as pilhas3da filha, as pilhas que dividiram podem ser distinguidas das pilhas undivididas pelo fluxo cytometry, que igualmente permite o fenotipagem quantitativo de populações do linfócito. Na verdade, o número de divisões que uma célula sofreu a partir do momento da coloração CFSE pode ser medido em algum grau5. Mais recentemente, muitas tinturas similares tais como a tintura violeta da proliferação de CellTrace (VPD) e a tintura de CytoTrack foram desenvolvidas, que trabalham em uma maneira similar6. Este protocolo centra-se no CFSE, mas os princípios aplicam-se ingualmente a outros corantes relacionados.
A coloração do tetrâmero de peptide-MHC é um método amplamente utilizado para detectar e clonar pilhas CD8+ T antígeno-específicas. Este é um método bem estabelecido7,8,9,10; Entretanto, a clonagem tetrâmero-baseada exige o conhecimento existente da limitação de epítopo mapeado/MHC e cada epítopo exige seu próprio tetrâmero11, que limita o espaço da descoberta e da clonagem de pilhas de T epítopo mapeado-específicas novas. A proliferação baseada em CFSE pode ser usada com peptídeos, proteínas ou lisados celulares. O protocolo aqui descrito é simples e robusto, e as células T CD4+ de resposta podem ser classificadas para uso em ensaios de caracterização funcional e bioquímica a jusante12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
A proliferação CFSE-baseada é um método simples e robusto para detectar e enumerar pilhas humanas antígeno-específicas de CD4+ T. Tem sido demonstrado previamente que a utilização da concentração óptima de CFSE é essencial para resultados óptimos4. Demasiada proliferação dos AB roga de CFSE, visto que demasiado pouco não permite que as pilhas divididas e undivide sejam distinguidas. Por outro lado, concentrações relativamente elevadas (5,0 μM) de CFSE são usadas para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por: o juvenil diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). O Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), diabetes Austrália Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), programa de apoio à infra-estrutura operacional do governo vitoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.), e NHMRC Bolsista de pós-graduação APP1094337 e JDRF PhD top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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