Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
Summary
Presentato qui è un protocollo per la misurazione delle cellule CD4 – T proliferanti in risposta a proteine antigeniche o peptidi utilizzando la diluizione del tinri. Questo analisi è particolarmente sensibile alle rare cellule T specifiche dell’antigene e può essere modificato per facilitare la clonazione delle cellule specifiche dell’antigene.
Abstract
Descritto è un metodo semplice, in vitro, basato sulla diluizione dei coloranti per misurare la proliferazione delle cellule T specifiche dell’antigene nelle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PMC). Lo sviluppo di coloranti stabili, non tossici e fluorescenti come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) consente di distinguere le cellule T rare e specifiche dell’antigene dai bystander per diminuzione della colorazione fluorescente, come rilevato dalla citometria di flusso. Questo metodo presenta i seguenti vantaggi rispetto agli approcci alternativi: (i) è molto sensibile alle cellule T a bassa frequenza, (ii) non è richiesta alcuna conoscenza dell’antigene o dell’epitopo, (iii) il fenotipo delle cellule rispondenti può essere analizzato e (iv) vitale, rispondente, rispondendo le cellule possono essere ordinate e utilizzate per ulteriori analisi, come la clonazione delle cellule T.
Introduction
La capacità di rilevare e studiare le cellule T specifiche dell’antigene è importante negli studi sull’immunità mediata dalle cellule. Tuttavia, in questo modo è particolarmente difficile per il CD4 specifico di autoantigen– risposte delle cellule T, che sono molto deboli e difficili da rilevare. Un metodo comune utilizzato per la rilevazione della proliferazione dei linfociti specifici dell’antigene è [3H]-thymidine, che è un nucleotide radioetichettato incorporato nel DNA delle cellule che proliferano. Anche se l’analisi [3H]-timinano può rilevare la sintesi del DNA, questo metodo è una misura indiretta della divisione cellulare, perché la sintesi del DNA può avviare indipendentemente dalla mitosi (cioè durante la duplicazione genica e l’apoptosi1). Questo problema è aggravato dal fatto che la proliferazione delle cellule specifichedell’antigene può provocare una notevole apoptosi 2, portando a una potenziale sopravalutazione della proliferazione specifica dell’antigene. Inoltre, il metodo [3H]-thymidine non fornisce informazioni fenotipiche per la proliferazione dei linfociti, come cd4o CD8– proliferazione del lignaggio nei PBMCC stimolati con peptidi antigenici.
Nel 2003, abbiamo pubblicato il primo saggio di diluizione del colorone utilizzando CFSE, chiamato il saggio di proliferazione basato su CFSE3,4. CFSE è un tinrito fluorescente che si lega stabilmente alle proteine intracellulari formando un legame covalente ai residui di lisina intracellulare. Poiché le proteine con etichetta CFSE sono divise equamente tra le cellule figlie3, le cellule che si sono divise possono essere distinte dalle cellule indivise per citometria di flusso, il che consente anche la fenotipizzazione quantitativa delle popolazioni di linfociti. Infatti, il numero di divisioni che una cellula ha subito dal momento della colorazione CFSE può essere misurato in una certa misura5. Più recentemente, sono stati sviluppati molti coloranti simili come cellTrace Violet proliferation colorante (VPD) e CytoTrack colorante, che funzionano in modo simile6. Questo protocollo si concentra su CFSE, ma i principi si applicano ugualmente ad altri coloranti correlati.
La colorazione del tetramer Peptide-MHC è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare e clonare cellule CD8– T specifiche dell’antigene. Questo è un metodo ben consolidato7,8,9,10; tuttavia, la clonazione basata su tetramer richiede una conoscenza esistente della restrizione epitope/MHC e ogni epitopo richiede un proprio tetramero11, che limita l’ambito di scoperta e clonazione di nuove cellule T specifiche dell’epitopo. La proliferazione basata su CFSE può essere utilizzata con peptidi, proteine o lismi cellulari. Il protocollo qui descritto è semplice e robusto, e il rispondente CD4– t cellule possono essere ordinati per l’uso in saggi di caratterizzazione funzionale e biochimica a valle12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La proliferazione basata su CFSE è un metodo semplice e robusto per rilevare ed enumerare le cellule CD4 umane specifiche dell’antigene e le cellule T. È stato dimostrato in precedenza che l’utilizzo della concentrazione ottimale di CFSE è essenziale per ottenere risultati ottimali4. Troppo CFSE abroga la proliferazione, mentre troppo poco non consente di distinguere le cellule divise e indivise. Al contrario, concentrazioni relativamente elevate (5,0 M) di CFSE vengono utilizzate pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Il National Health and Medical Research Council (NHMRC GNT123586) (S. M.), Il Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), il Programma operativo di supporto alle infrastrutture del governo vittoriano (S. M., A. D., E. T., M.S.) e NHMRC) e NHMRC Borsa di studio post-laurea APP1094337 e JDRF PhD Top-up Scholarship (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
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