カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化
Summary
ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。
Abstract
記載されているのは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)における抗原特異的CD4+T細胞増殖を測定するための簡便な、インビトロ、色素希釈ベースの方法である。カルボキシフルオレセイン・スクハニミジルエステル(CFSE)のような安定した、非毒性の蛍光色素の開発は、フローサイトメトリーによって検出されるような蛍光染色における減少によって、まれな抗原特異的T細胞を傍観者と区別することを可能にする。この方法は、代替アプローチに対して次の利点があります:(i)低周波T細胞に対して非常に敏感であり、(ii)抗原またはエピトープの知識が必要とされない、(iii)応答細胞の表現型を分析することができ、(iv)生存可能な応答セルを並べ替え、T セルのクローニングなどのさらなる分析に使用できます。
Introduction
抗原特異的T細胞を検出し、研究する能力は、細胞媒介性免疫の研究において重要である。しかし、これを行うことは、非常に弱く、検出が困難な自己抗原特異的CD4+T細胞応答のために特に困難です。抗原特異的リンパ球増殖の検出に使用される一般的な方法は[3H]-チミジンであり、これは増殖細胞のDNAに組み込まれた放射性標識ヌクレオチドである。[3H]-チミジンアッセイはDNA合成を検出できますが、この方法は細胞分裂の間接的な尺度であり、DNA合成は、遺伝子の複製およびアポトーシス1の間に独立して開始することができるので、細胞分裂の間接的な尺度である。この問題は、細胞の抗原特異的増殖がかなりのアポトーシス2をもたらす可能性があるという事実によって悪化し、抗原特異的増殖の潜在的な過大評価につながる。さらに、[3H]-チミジン法は、抗原ペプチドで刺激されたPBMCにおけるCD4+またはCD8+系統増殖などの増殖リンパ球に対する表現型情報を提供しない。
2003年には、CFSEを用いて初めての染料希釈アッセイを発表し、CFSEベースの増殖アッセイ3、4と呼ばれる。CFSEは、細胞内リジン残渣に対する共生結合を形成することにより、細胞内タンパク質に安定的に結合する蛍光色素です。CFSE標識タンパク質は娘細胞3の間で均等に分かれているので、分裂した細胞はフローサイトメトリーによって未分裂細胞と区別することができ、これはリンパ球集団の定量的表現型を可能にする。確かに、細胞がCFSE染色の時から受けた分裂の数は、ある程度5まで測定することができる。最近では、CellTraceバイオレット増殖色素(VPD)やCytoTrack色素などの多くの同様の染料が開発されており、同様の方法で動作します6。このプロトコルはCFSEに焦点を当てていますが、原理は他の関連染料にも同様に適用されます。
ペプチド-MHCテトラマー染色は、抗原特異的CD8+T細胞を検出およびクローニングするための広く使用されている方法である。これは、確立された方法7、8、9、10です。しかし、テトラマーベースのクローニングは、エピトープ/MHC制限の既存の知識を必要とし、各エピトープは、新規エピトープ特異的T細胞の発見およびクローニングの範囲を制限する独自のテトラマー11を必要とします。CFSEベースの増殖は、ペプチド、タンパク質、または細胞のライサットと使用することができます。ここに記載されるプロトコルは、シンプルかつ堅牢であり、応答CD4+T細胞は、下流の機能性および生化学的特徴付けアッセイ12、13で使用するためにソートすることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSEベースの増殖は、抗原特異的ヒトCD4+T細胞を検出および列挙するためのシンプルで堅牢な方法です。CFSEの最適な濃度を使用することは、最適な結果4のために不可欠であることを以前に実証されています。あまりにも多くのCFSEは増殖をアブローしますが、あまりにも少なすぎると、分割された細胞と分割されていない細胞を区別することはできません。対照的に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、若年性糖尿病研究財団[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)によって支援されました。国家保健医療研究評議会(NHMRC GNT123586)、糖尿病オーストラリア研究信託ミレニアム賞(Y17M1-MANS)(S.M.)、ビクトリア州政府の運用インフラ支援プログラム(S.M.、A.D.、E.T.、M.S.)、およびNHMRC大学院奨学金APP1094337とJDRF博士トップアップ奨学金(M.S.)。
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
