JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Режиме реального времени в Vitro мониторинга одоранта рецептор активации одоранта в паровой фазе

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Физиологически одорант рецепторы активируются одоранта молекул вдыхается в паровой фазе. Однако большинство в пробирке систем используют жидкой фазы одоранта стимуляции. Здесь мы представляем метод, который позволяет в реальном времени в пробирке мониторинга одоранта рецептор активации после стимуляции одоранта в паровой фазе.

Abstract

Обонятельные восприятие начинается с взаимодействием отдушки с рецепторами одоранта (или) выраженные обонятельной сенсорных нейронов (ОСН). Запах признание следующим комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. Через такие комбинаторной кодирования, организмы можно обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Таким образом запах при данной концентрации можно описать активации шаблон СПР, который специфичен для каждого запаха. В этом смысле, растрескивание механизмы, которые мозг использует для восприятия запахов требует понимания одоранта-или взаимодействия. Вот почему обоняние сообщество привержено «де orphanize» эти рецепторы. Обычные в пробирке систем, используемых для идентификации одоранта- или взаимодействия использовали инкубирования ячейки СМИ с одоранта, который отличается от естественной обнаружения запахи через пара отдушки растворения в слизистую оболочку носа до взаимодействия с СПР. Здесь мы опишем новый метод, который позволяет для реального времени наблюдения или активации через паровой фазы отдушки. Наш метод основан на измерения лагеря выхода люминесценции, используя Glosensor assay. Он ликвидирует нынешние пробелы между подходами в vivo и in vitro и обеспечивает основу для biomimetic летучих химических датчика.

Introduction

Обоняние позволяет наземных животных взаимодействовать с их летучие химические среды привод поведения и эмоции. По существу процесс обнаружения запаха начинается с самого первого взаимодействия молекул одоранта с обонятельной системы, на уровне одоранта рецепторов (СПР)1. В млекопитающих ORs индивидуально выражаются в обонятельной сенсорных нейронов (OSNs), расположенный в обонятельного эпителия2. Они принадлежат к семейству рецепторов (GPCR) G-протеин и более точно родопсин как суб семье (также называемый класса A). СПР пара с стимулирующее G протеина GФОО чьи Активация приводит к лагеря производства последовали открытия циклических нуклеотидов воротами каналов и поколения потенциалы действия. Принято что ощутили запах опирается на определенный шаблон активированного СПР3,4 и поэтому запах признание комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. И через такие комбинаторной кодирования, постулируется, что организмы может обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Один из ключей к пониманию, как воспринимают запахи — чтобы понять, как и ORs активируются данной запах.

В попытке прояснить одоранта- или взаимодействия, в пробирке функциональных анализов играют важную роль. Идентификация агонист пахучих лигандов для сирот ORs (или де orphanization) был очень активное поле за последние двадцать лет, с использованием различных в пробирке, ex vivo и в естественных условиях функциональных анализов5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,,1516, 17.

В пробирке пробирного системы лучше всего подходит для подробных функциональных характеристик ПРС, включая определение функциональные домены и критических остатков СПР, а также потенциал инженерных приложений. Однако дальнейшее развитие ценных в пробирке систем для СПР был вызов, отчасти из-за трудностей с культивирования OSNs и функциональных выражение ORs в гетерологичных клеток. Первая задача заключалась в создании протоколов, которые разрешены для клеток поверхности выражения функциональной ORs в сопоставлении одоранта-или взаимодействия. Ряд независимых групп использовали различные подходы5,6,,78,9,10,11,12, 14,18,19,20. Одним из первых достижений было сделано, Krautwurst et al. в меткой N-конечная СПР с укороченной последовательность родопсина (Ро тегов) и наблюдается улучшение поверхности выражение в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)13. Изменения, сделанные в тег придает последовательность или все еще путь для улучшения или выражение и функциональность19,21. Сайто et al. затем определил транспортировки рецептора протеина 1 (RTP1) и RTP2, который содействует или торговле. 22 сокращенный вариант RTP1, называемый RTP1S, также было показано быть даже более эффективным, чем оригинальный белка23. Разработка клеточной линии (Hana3A), которая стабильно выражает GФОО, REEP1, RTP1 и RTP2 24, в сочетании с использованием Репортеры циклический аденозинмонофосфат (лагерь) позволило идентификации одоранта-или взаимодействия. Механизм, по которому RTP семейство белков способствует клеток поверхности выражение ORs предстоит определить.

Одно предостережение этих установленных методов является, что они полагаются на стимуляции одоранта в жидкой фазе, что означает отдушки предварительно растворяют в средство стимуляции и стимулировать клетки путем замены носителя. Это очень отличается от физиологических условиях где одоранта молекулы достигают обонятельного эпителия в паровой фазе и активировать ORs путем растворения в слизистой оболочки носа. Для больше напоминают воздействия физиологически соответствующие стимулы, Sanz et al.20 предложил assay основанный на стимуляции пара путем нанесения капли раствора одоранта повесить под с внутренней стороны пластиковой пленки, размещены на верхней части клетки скважин. Они записали кальция ответы путем мониторинга интенсивности флуоресценции. Этот метод был первым для использования воздуха фаза одоранта стимуляции, но она не позволяет большой показ или активации.

Здесь мы разработали новый метод, который позволяет в режиме реального времени мониторинг в пробирке или активации через паров этапе одоранта стимуляции Glosensor пробу (рис. 1). Этот assay был использован ранее в контексте жидких одоранта стимуляции18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. Мониторинг палаты Люминометр сначала достижение равновесного уровня с испаряется одоранта до пластины чтения (рис. 1А). Одорант молекулы, затем сольватированного в буфер, купание Hana3A клетки, выражая или интерес, RTP1S и Glosensor белков (рис. 1Б). Если одорант агонистов или, или переключиться на активированные конформации и привязать GФОО, активации гуанилатциклазы adenylyl (AC) и в конечном итоге вызывают повышение уровня лагеря. Этот рост лагерь будет связывать и активировать Glosensor белка для создания свечения, катализирующих люциферин. Это свечение затем регистрируется с помощью люминометра и позволяет осуществлять мониторинг или активации. Этот метод является большой интерес в контексте или deorphanization, как он приносит в пробирке систем ближе к естественной восприятие запахов.

Protocol

1. Hana3A клетки культуры Подготовить M10 (минимум основных средних (MEM) плюс 10% v/v плода бычьим сывороточным (ФБС)) и M10PSF (М10 плюс 100 мкг/мл пенициллин стрептомицином и амфотерицин B 1,25 мкг/мл). Культура клетки в 10 мл M10PSF в 100 мм ячейку культуры блюдо в инкубаторе в 37 ° C и 5% двуокиси углеро…

Representative Results

Мы показан ответ три мыши ORs, Olfr746, Olfr124 и Olfr1093 с помощью оксима пара стимуляции (рис. 3). Одновременно, мы использовали элемент пустой вектор (Ро pCI), чтобы заверить, что одоранта индуцированной деятельности протестированных ОРС были конкретные (рисA…

Discussion

Восприятие запаха принципиально зависит от активации ORs. Следовательно для того чтобы треснуть сложные механизмы, использующие мозг воспринимать его летучие химические среды требуется понимание их функциональность. Однако понимание этого процесса сдерживается трудностями в создани…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от них (DC014423 и DC016224) и обороны передовых исследований агентства RealNose проекта. YF остался в университете Дьюка при финансовой поддержке программы JSP-страницы для продвижения стратегических международных сетей для ускорения циркуляции талантливых исследователей (R2801). Мы благодарим Sahar Калима для редактирования рукописи.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -. K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the “grassy” smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Odorant ReceptorIn Vitro MonitoringVapor PhaseBiosensorOdor PerceptionCell CultureReal-timeM10 PSFTrypsin-EDTA96-well Plate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image