JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Abstract

Koku algı odorants etkileşim propil reseptörleri ile başlar (veya) koku duyusal sinir hücreleri tarafından (OSN) dile getirdi. Koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile etkinleştirilebilir ve bir propil ORs bir arada etkinleştirebilirsiniz bir birleşimsel kodlama düzeni izler. Böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayırımcılık. Böylece, belirli bir konsantrasyon, bir koku ORs, tarafından bir harekete geçirmek desen her koku için belirli olan tanımlanabilir. Bu anlamda, koku gerektirir anlayış propil algıladıkları için beyin kullandığı düzeneklerini çatlama-OR etkileşimleri. Bu yüzden koku alma toplum “Bu reseptörleri de-orphanize için” taahhüt eder. Propil tanımlamak için kullanılan geleneksel tüp bebek sistemleri- veya etkileşimler ORs ile etkileşim daha önce doğal algılama kokuları buharı odorants dağılması ile burun mukozası içine sorumluluk alanlarından olan hücre ortamla kuluçka propil, kullanılan. Burada, OR etkinleştirme buharı fazlı odorants üzerinden gerçek zamanlı izlenmesi için izin yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim yöntem Glosensor tahlil kullanarak ışıldama tarafından kamp yayın ölçme üzerinde dayanır. İçinde vivo ve tüp bebek yaklaşımlar arasındaki geçerli boşlukları arasında köprü görevi gören ve bir biomimetic uçucu kimyasal duyumsal için bir temel sağlar.

Introduction

Koku alma duygusu karasal hayvanlar uçucu kimyasal çevreleri sürücü davranışları ve duyguları ile etkileşimine izin verir. Temelde, koku alma sistemi, propil reseptörleri (ORs)1düzeyinde ilk etkileşim propil moleküllerin koku Algılama işlemi başlar. Memelilerde, ORs tek tek koku epitel2‘ de yer alan koku duyusal nöronlar (OSNs) ifade edilir. Ait oldukları G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) ailesi ve daha doğrusu rhodopsin benzeri alt aile (sınıf A olarak da bilinir). ORs çift kimin harekete geçirmek ardından döngüsel nükleotit geçişli kanal açılması ve aksiyon potansiyelleri nesil kamp üretim yol açan uyarıcı G protein Golf ile. Bir koku algılama etkinleştirilmiş ORs3,4 belirli bir desen kullanır ve bu nedenle koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile aktif ve bir propil etkinleştirmek bir birleşimsel kodlama düzeni izler kabul edilen bir ORs birleşimi. Ve böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, bu organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayrımcılık öne ise. Bir kokuları nasıl algılandığını anlamak için anahtar olduğunu anlamak için nasıl ve hangi ORs tarafından verilen bir koku harekete geçirmek.

Bir girişim propil aydınlatmak için- veya etkileşimler, tüp bebek fonksiyonel deneyleri önemli bir rol oynamıştır. Yetim ORs (OR de-orphanization) için agonist kokulu ligandlar tanımlaması çok aktif bir alan son yirmi yıldır, ex vivo ve içinde vivo işlevsel testleri5,6,7 tüp bebek, çeşitli aracılığıyla olmuştur ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

İn vitro tahlil sistemleri en iyi ORs işlevsel etki alanları ve kritik artıkları ORs yanı sıra potansiyel mühendislik uygulamaları da dahil olmak üzere, ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Ancak, daha fazla değerli tüp bebek sistemlerinin geliştirilmesi için ORs kodlamayla OSNs ile zorluk ve kapaklı hücrelerdeki ORs işlev ifadesi nedeniyle kısmen bir mücadele vardı. İlk challenge propil haritalama işlevsel ORs hücre yüzey ifade için izin iletişim kuralları kurmak için olmuştu-OR etkileşimleri. Bir dizi bağımsız gruplar çeşitli yaklaşımlar5,6,7,8,9,10,11,12kullanılan, 14,18,19,20. En erken başarılarından Krautwurst vd tarafından yapıldı ın rhodopsin (Rho-etiket) kısaltılmış bir dizi ile N-terminus, ORs öğesini ve geliştirilmiş yüzey ifade insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri13‘ te görülmektedir. Varyasyonları OR dizisine bağlı etiketi için yapılan olduğunu hala bir yol OR ifade ve işlevselliği19,21artırmak için araştırdı. Saito ve ark. sonra teşhis reseptör taşıma proteini 1 (RTP1) ve OR ticareti kolaylaştırmak RTP2. 22 RTP1, RTP1S, olarak adlandırılan daha kısa bir sürümünü de özgün protein23daha da etkili olduğu gösterilmiştir. Geliştirme stabil Golfifade bir hücre satırı (Hana3A), siklik adenozin monofosfattır (kampı) gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde REEP1, RTP1 ve RTP2 24, propil tanımlaması sağladı-OR etkileşimleri. Hangi RTP aile proteinlerin hücre yüzey ifade belirlenecek ORs kalıntılarının teşvik mekanizması.

Kurulan bu yöntemlerin bir uyarı onlar odorants bir stimülasyon orta önceden çözülür ve orta değiştirerek hücreleri uyarmak anlamında propil stimülasyon sıvı faz, güvenmek olduğunu. Bu fizyolojik şartlarda nerede propil molekülleri koku epitel buharı aşamasında ulaşmak ve ORs dağılması tarafından nazal mukoza etkinleştirmek çok farklıdır. Daha yakından benzer fizyolojik ilgili uyarıcı pozlama, Sanz vd.20 altında hücre kuyu üstüne yerleştirilen bir plastik film iç yüzü asmaya propil çözüm bir damla uygulayarak buharı stimülasyon üzerinde dayalı bir tahlil evlenme teklif etti. Onlar kalsiyum yanıt floresan yoğunluğu izleme tarafından kaydedildi. Bu yöntem ilk hava fazlı propil stimülasyon kullanın, ama OR harekete geçirmek büyük bir tarama izin vermedi.

Burada, gerçek zamanlı buharı faz propil stimülasyon ile tüp bebek OR etkinleştirme Glosensor assay (şekil 1) tarafından izlenmesi sağlar yeni bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil daha önce sıvı propil stimülasyon18,19,25,26,27,28,29, bağlamında kullanılan 30 , 31. luminometer izleme odası ilk plaka (şekil 1A) okuma önce buharlaşmış propil ile equilibrated. Propil moleküllerdir sonra faiz, RTP1S ve Glosensor proteinler (şekil 1B) OR ifade Hana3A hücreleri banyo arabellek içine solvated. Propil bir agonist or ise, OR için aktif bir uyum geçin ve gozlemler cyclase (AC) aktive Golf, bağlama ve sonuçta kamp düzeyleri yükselmeye neden. Yükselen bu kampı bağlamak ve Glosensor protein biyoluminesans katalizlerler ışıma oluşturmak için harekete geçirmek. Bu ışıma sonra luminometer tarafından kaydedilir ve OR etkinleştirme izleme sağlar. Tüp Bebek sistemleri yakınlaştırmayı kokular doğal algı getiriyor gibi yüksek faiz OR deorphanization bağlamında bu yöntem kullanılabilir.

Protocol

1. Hana3A kültür hücreleri M10 hazırlayın (en az önemli orta (MEM) artı % 10 v/v fetal sığır serum (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B). M10PSF 100 mm hücre kültür bulaşık kuluçka 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) ayarla içinde içinde 10 mL hücrelerde kültür. 2 günde % 20 oranında Hücreleri Böl: % 100 izdiham hücre (yaklaşık 1.1 x 107 hücreleri) faz kontrast mikroskop altında gözlene…

Representative Results

Yanıt üç fare ORs, Olfr746, Olfr124 ve Olfr1093 ekranlı cinnamaldehyde buharı stimülasyon (şekil 3) kullanarak. Aynı anda, biz test ORs propil kaynaklı faaliyetlerinin belirli sağlamak için bir boş vektör kontrolü (Rho-PCI) kullanılan (şekil 3A). ORs buharı propil uyarıcı üzerine gerçek zamanlı etkinleştirme izlenen 20’den fazla ölçüm devir oldu. Her veri de ilk boş vektör kontrolü ortalama değerine her çevriminde …

Discussion

Koku algı temelde ORs etkinleştirme üzerinde bağlıdır. Sonuç olarak, anlayış işlevleriyle beyin kullanın uçucu kimyasal çevresine algıladıkları için karmaşık mekanizmaları çatlamak için gereklidir. Ancak, bu işlem anlayış tarafından OR repertuar odorants tüp bebek. karşı işlevsellik için ekran için sağlam bir yöntem oluşturulmasında zorluklar engel Hücre ORs yüzey ve kapaklı ifade kısmen çözüldü etiketli reseptörleri13,<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIH (DC014423 ve DC016224) ve savunma ileri araştırma ajansı RealNose projesi hibe tarafından desteklenmiştir. YF JSP’ler Program stratejik Uluslararası ağlar, yetenekli araştırmacıların dolaşımı (R2801) hızlandırmak ilerlemek için mali desteği ile Duke Üniversitesi’nde kaldı. Sahar Kaleem yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -. K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the “grassy” smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Odorant ReceptorIn Vitro MonitoringVapor PhaseBiosensorOdor PerceptionCell CultureReal-timeM10 PSFTrypsin-EDTA96-well Plate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image