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Neuroscience

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Fisiologicamente, odorante receptores são ativados por moléculas odorant inaladas na fase de vapor. No entanto, mais sistemas in vitro utilizam o stimulation de odorante de fase líquida. Aqui, apresentamos um método que permite o monitoramento em tempo real e in vitro da ativação de receptores odorant após estimulação odorant em fase vapor.

Abstract

Percepção olfativa começa com a interação dos odorantes com os receptors odorant (ou) expressas pelos neurônios sensoriais olfativos (OSN). Reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar uma combinação de ORs. Através de tal codificação combinatória, organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Assim, um odor em uma dada concentração pode ser descrito por um padrão de ativação do RUP, que é específico de cada odor. Nesse sentido, quebrando os mecanismos que o cérebro usa para perceber odor requer o entendimento odorant-interações OR. Eis porque a comunidade de olfação está empenhada em “de orphanize” estes receptores. Sistemas convencionais in-vitro, usados para identificar o odorant- ou interações têm utilizado a incubação mídia celular com odorante, que é distinta da natural detecção de odores através da dissolução de odores de vapor na mucosa nasal antes interagindo com RUP. Aqui, descrevemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real de ativação OR através do vapor-fase odorantes. Nosso método se baseia na medição acampamento lançamento por luminescência usando o ensaio de Glosensor. Ele preenche lacunas atuais entre abordagens in vivo e in vitro e fornece uma base para um sensor de químicos voláteis biomimético.

Introduction

O sentido do olfato permite animais terrestres interagir com seu ambiente químico volátil para unidade comportamentos e emoções. Fundamentalmente, o processo de detecção de odor começa com a primeira interação de moléculas odorant com o sistema olfativo, ao nível da odorant receptores (ORs)1. Nos mamíferos, RUP individualmente são expressos em neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizados no epitélio olfatório2. Pertencem à família de receptores (GPCR) proteína G-acoplada e mais precisamente a rodopsina, como sub da família (também chamado de classe A). Casal de SRO com o estimulatórios G proteína Golf cuja ativação leva à produção de campo seguida a abertura de canais de nucleotídeo cíclico fechado e a geração de potenciais de ação. Aceita-se que um perceptivo de odor se baseia em um padrão específico de ativado ORs3,4 e, por conseguinte, o reconhecimento de odor segue um esquema de codificação combinatório, onde um OR pode ser ativado por um conjunto de odores e um odorante pode ativar um combinação de ORs. E através de tal codificação combinatória, postula-se que os organismos podem detectar e discriminar entre uma miríade de moléculas voláteis de odor. Uma das chaves para a compreensão de como os odores são percebidos é entender como e que RUP são ativadas por um determinado odor.

Na tentativa de elucidar odorant- ou interações, ensaios funcionais in vitro têm desempenhado um papel essencial. A identificação de ligantes odoríferos de agonista para órfão ORs (orphanization de OR) tem sido um campo muito ativo nos últimos vinte anos, através da utilização de vários in-vitro, ex vivo e in vivo de ensaios funcionais5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

Sistemas de ensaio in vitro são mais adequados para a caracterização funcional detalhada das RUP, incluindo a identificação dos domínios funcionais e resíduos críticos das regiões ultraperiféricas, bem como potenciais aplicações de engenharia. No entanto, mais desenvolvimento de sistemas in vitro valiosos para RUP tem sido um desafio, em parte devido à dificuldade com OSNs cultivo e expressão funcional das RUP em células heterólogos. O primeiro desafio foi estabelecer protocolos que permitiu a expressão de superfície celular de SRO funcional no mapeamento de odorante-interações OR. Um número de grupos independentes que utilizaram várias abordagens5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uma das primeiras realizações foi feita por Krautwurst et al. em tagged N-terminal do RUP com uma sequência curta de rodopsina (Rho-marca) e observaram uma expressão superfície melhorada em células de rim humano embrionário (HEK)13. Variações feitas para a etiqueta colada à sequência de OR é ainda um caminho explorado para melhorar OR expressão e funcionalidade19,21. Saito et al.. , em seguida, identificou a proteína do receptor-transporte 1 (RTP1) e RTP2 que facilitem tráfico de OR. 22 uma versão mais curta da RTP1, chamado RTP1S, também foi mostrada para ser ainda mais eficaz do que a proteína original23. O desenvolvimento de uma linha de celular (Hana3A) que expressa estàvel Golf, REEP1, RTP1 e RTP2 24, juntamente com o uso de repórteres de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) permitiu a identificação de odorante-interações OR. O mecanismo pelo qual a família RTP de proteínas promove a expressão de superfície celular de SRO permanece para ser determinado.

Uma limitação destes métodos estabelecidos é que eles dependem de odorante estimulação na fase líquida, significando que odorantes pre-são dissolvidos em um meio de estimulação e estimulam as células, substituindo o meio. Isto é muito diferente as condições fisiológicas onde moléculas odorant atingir o epitélio olfatório em fase vapor e ativar SRO por dissolução em mucosa nasal. Para mais se assemelham a exposição de estímulo fisiologicamente relevantes, Sanz et al20 propôs um ensaio com base na estimulação vapor aplicando uma gota de solução de odorante para pendurar sob a face interna de um filme plástico colocado no topo de poços de célula. Eles gravaram as respostas de cálcio, monitorando a intensidade de fluorescência. Este método foi o primeiro a usar a estimulação de odorante ar-fase, mas não permitia uma grande seleção de ativação OR.

Aqui, nós desenvolvemos um novo método que permite o monitoramento em tempo real da ativação de OR in vitro através de estimulação de odorante de fase vapor por Glosensor ensaio (Figura 1). Este ensaio tem sido usado anteriormente no contexto do líquido odorant estimulação18,19,25,26,,27,28,29, 30 , 31. a câmara de vigilância do luminómetro primeiro é incubada com odorant vaporizado antes da placa (Figura 1A) de leitura. Odorant moléculas são então solvated o buffer, banhando as células Hana3A, expressando o ou de interesse, RTP1S e as proteínas Glosensor (Figura 1B). Se o odorant é um agonista dos OR, o OR mudar para o uma conformação registrada e vincular o Golf, ativando a adenilato ciclase (AC) e em última análise, causar níveis acampamento a subir. Este acampamento nascente irá vincular a e ativar a proteína Glosensor para gerar luminescência catalisar luciferina. Esta luminescência é então gravada pelo luminómetro e possibilita o monitoramento de ativação OR. Esse método é de grande interesse no contexto do deorphanization OR pois traz sistemas in vitro mais próxima à natural percepção de odores.

Protocol

1. Hana3A células de cultura Preparar M10 (meio essencial mínimo (MEM) mais 10% de soro bovino fetal (FBS) de v/v) e M10PSF (M10 e mais de 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B). Cultura de células em 10 mL de M10PSF em um prato de cultura de célula de 100 mm em uma incubadora a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2). Divida as células a cada 2 dias na proporção de 20%: quando a confluência de 100% das células (aproximadamente 1.1 x 10<sup…

Representative Results

Nós selecionados a resposta de três rato RUP, Olfr746, Olfr124 e Olfr1093 usando estimulação vapor de cinamaldeído (Figura 3). Simultaneamente, usamos um controle de vetor vazio (Rho-pCI) para garantir que as atividades de odorante-induzida das RUP testadas foram específicas(Figura 3). A ativação em tempo real das RUP mediante estímulo de vapor odorante foi monitorado ciclos de medição mais de 20. Os dados para cada bem primeiro foram…

Discussion

A percepção de odor é fundamentalmente dependente da ativação de ORs. Por conseguinte, compreensão de sua funcionalidade é necessária para quebrar os mecanismos complexos que usam o cérebro para perceber seu ambiente químico volátil. No entanto, a compreensão deste processo tem sido dificultada pelas dificuldades em estabelecer um método robusto para o repertório de OR para funcionalidade contra odores in vitro. da tela Célula expressão heteróloga e superfície do RUP foi parcialmente resolvido …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (DC014423 e DC016224) e o defesa avançada pesquisa Agência RealNose projeto. YF permaneceu na Duke University, com apoio financeiro do programa JSPS para avanço estratégico internacional redes acelerar a circulação de talentosos pesquisadores (R2801). Agradecemos a Sahar Kaleem para edição do manuscrito.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
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