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Neuroscience

気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro の監視を可能にする方法を紹介します。

Abstract

嗅覚は嗅覚受容体と匂い分子の相互作用で始まる (または) 嗅覚ニューロン (国連) によって表現されます。臭気の認識に続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの匂いが嗅覚受容体の組み合わせをアクティブ化できます。このような組合せのコーディング、生物は検出し、揮発性の匂い分子の無数の間で区別できます。したがって、所定濃度の臭気で記述できる、嗅覚受容体の活性化パターン各臭気に固有であります。その意味で、脳を使用して臭気が必要理解匂いを知覚するメカニズムを割れ-または相互作用。これはなぜ嗅覚コミュニティが”デ orphanize”これらの受容器にコミットです。臭気物質を識別するために使用される従来の in vitro システム-相互作用は嗅覚、インキュベーター携帯メディアを利用する ORs と対話する前に鼻粘膜に蒸気匂い解散による悪臭の自然の検出とは異なるであるか。ここでは、気相匂いを経由してまたはアクティベーションをリアルタイムで監視できる新しい手法について述べる。本手法は、Glosensor のアッセイを用いた発光によるキャンプ リリースを測定に依存します。それは生体内および生体外でのアプローチとの間の現在のギャップをブリッジし、バイオミメティック揮発性化学センサーの基礎を提供します。

Introduction

嗅覚には、ドライブの動作や感情に揮発性化学物質の環境と対話する陸生動物ことができます。基本的に、臭気の検出プロセスは嗅覚受容体 (ORs)1のレベルで、嗅覚システムと匂い分子の非常に最初の対話から始まります。哺乳類、ORs 個別2嗅上皮にある嗅覚の感覚ニューロン (OSNs) で表されます。彼らは、G タンパク質共役受容体 (GPCR) 家族にロドプシンのような亜科 (クラス A とも呼ばれます) をより正確に属します。ORs のカップル、促進 G 蛋白質 Golfが活性化 cAMP の産生が続く環状ヌクレオチド ゲート チャネルの開口部と活動電位の発生に 。それが受け入れられる匂い知覚を活性化 Or3,4の特定のパターンに依存している、従って臭気の認識続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの臭気物質をアクティブにできます、ORs の組み合わせ。このような組合せのコーディング、それは生物が検出でき、揮発性の匂い分子の無数の間で区別を仮定したが。匂いを知覚する方法を理解するキーの 1 つは理解する、どのようにと ORs は与えられた臭気によって活性化されます。

臭気物質を解明する試みで- または相互作用、体外機能アッセイは、重要な役割を果たしています。ORs (OR オーファン) の孤児アゴニスト匂いリガンドの同定は、過去 20 年間、様々 な生体内および生体内機能アッセイ5,6,7 ex 体外を使用して非常にアクティブなフィールドをされています。 ,8,9,10、11,12,13,14,15,16、 17。

In vitro アッセイ システムは ORs、機能的なドメインと、ORs として潜在的なエンジニア リング アプリケーションの重要な残基を識別するなどの詳細な機能解析に最適です。しかし、さらに ORs の貴重な培養システムの開発に一部養殖 OSNs の難しさと異種細胞における嗅覚受容体の機能発現のための挑戦をされています。嗅覚のマッピング機能嗅覚受容体の細胞表面発現の許可プロトコルを確立する最初の課題であった-または相互作用。いくつかの独立したグループは、様々 なアプローチ5,6,7,8,9,10、11,12を利用して 14,18,19,20。初期成果の一つは Krautwurst らによって作られたロドプシン (Rho-タグ) の短縮シーケンスと ORs の N 末端タグし、人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 細胞13で改善された表面式を観察。またはシーケンスに付属のタグに作られたバリエーションはまだまたは表現と機能19、21の改善のために探検パスです。斎藤ら.は、受容体輸送蛋白質 1 (RTP1) を識別および RTP2 または人身売買を促進します。22 RTP1、呼ばれる RTP1S の短いバージョンは、元蛋白質23よりも効果的であることも示されています。開発 Golfを安定して表現する細胞株 (Hana3A) の REEP1、RTP1、RTP2 24, 環状アデノシン一リン酸 (cAMP) 記者の使用と相まってが匂いの識別を有効になって-または相互作用。RTP 蛋白質族が嗅覚受容体の細胞表面発現を促進するメカニズムはまだ未定します。

これらの確立された方法の 1 つの警告は、匂い刺激中に分解済み媒体を置き換えることにより細胞を刺激することを意味液体相における嗅覚刺激に依存していることです。これは匂い分子気相の嗅上皮に到達し、溶解することによって鼻粘膜に ORs をアクティブにする生理学的条件から非常に異なります。密接に関連する生理学的刺激の露出のように、サンスら20セル井戸の上に配置プラスチック フィルムの内側の面の下にハングアップする臭気物質溶液の一滴を適用することによって蒸気の刺激に基づくアッセイを提案しました。彼らは、蛍光強度を監視することによってカルシウム応答を記録しました。本法では、気相嗅覚刺激を使用する最初が、それはまたは活性化の大規模なスクリーニングを許可しませんでした。

ここでは、Glosensor の試金 (図 1) によって蒸気相嗅覚刺激を経由して体外またはアクティベーションのリアルタイム モニタ リングを可能にする新しい方法を開発しました。この試金は液体の匂い刺激18,19,25,26,27,28,29,のコンテキストで以前使用されています30,31. 監視、ルミノ商工はまずプレート (図 1A) を読む前に気化した匂いと平衡に達した。匂い分子が関心、RTP1S と Glosensor 蛋白質 (図 1B) の OR を発現する Hana3A 細胞を入浴、バッファーに溶媒和になります。匂いは OR のアゴニスト、またはバインド Golfアデニル酸シクラーゼ (AC) を活性化されると最終的に上昇する cAMP のレベルを引き起こす活性構造への切り替えこの上昇のキャンプにバインドし、発光ルシフェリンを触媒を生成する Glosensor 蛋白質をアクティブにします。この発光は、ルミノ メーターで記録し、またはライセンス認証の監視を有効に。このメソッドは、悪臭の自然な知覚に近い生体外でシステムをもたらすそれコンテキストまたは deorphanization の関心が高いのです。

Protocol

1. Hana3A 細胞培養 M10 を準備 (最小必須培地 (MEM) プラス 10 %v/v ウシ胎児血清 (FBS)) と M10PSF (M10 100 μ g/mL ペニシリン-ストレプトマイシンと 1.25 μ g/mL アムホテリシン B プラス)。 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) でインキュベーターで 100 mm 細胞培養皿の M10PSF の 10 mL の細胞を培養します。 20% の比率で 2 日おきのセルを分割: 位相差顕微鏡下で細胞 (約 1.1 × 10 の7セ…

Representative Results

3 マウス ORs、Olfr746、Olfr124、Olfr1093 の応答で仕切った桂皮アルデヒド蒸気の刺激 (図 3) を使用します。テストの嗅覚受容体の匂いによる活動が特定されたことを保証するために空のベクター コントロール (Rho-pCI) を用いて同時に (図 3A)。蒸気嗅覚刺激に ORs のリアルタイム アクティブ化は、監視対象の以上 20 の測定サイクルだった。?…

Discussion

臭気の認識は根本的に嗅覚受容体の活性化に依存しています。その結果、それらの機能の理解がその揮発性の化学的環境を知覚する脳を使用して、複雑なメカニズムを解読する必要です。しかし、このプロセスの理解は、匂いの in vitro.に対して機能またはレパートリーを選別する手法を確立する難しさによって妨げられています。携帯タグ受容体13,<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH (DC014423 および DC016224) および防衛先端研究プロジェクト庁 RealNose プロジェクトからの補助金によって支えられました。YF は才能の研究 (R2801) の循環を加速させる戦略的な国際ネットワークを進めるため JSP プログラムからの財政支援とデューク大学に滞在しました。サハル Kaleem は、原稿の編集を感謝いたします。

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
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References

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Odorant ReceptorIn Vitro MonitoringVapor PhaseBiosensorOdor PerceptionCell CultureReal-timeM10 PSFTrypsin-EDTA96-well Plate

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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
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