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Neuroscience

En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Physiologiquement, les odorants récepteurs sont activés par des molécules odorantes inhalés en phase vapeur. Cependant, la plupart des systèmes in vitro utilisent une stimulation de la phase liquide odorant. Nous présentons ici une méthode qui permet un suivi en temps réel in vitro de l’activation des récepteurs odorants lors de la stimulation de la substance odorante en phase gazeuse.

Abstract

La perception olfactive commence par l’interaction des substances odorantes avec les récepteurs odorants (ou) exprimé par les neurones sensoriels olfactifs (OSN). Reconnaissance de l’odeur suit un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer une combinaison d’ORs. Grâce à ce codage combinatoire, les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Ainsi, une odeur à une concentration donnée peut être décrit par un modèle d’activation des RUP, qui est propre à chaque odeur. En ce sens, fissuration des mécanismes que le cerveau utilise pour percevoir l’odeur nécessite la compréhension odorant-interactions OR. C’est pourquoi la communauté de l’olfaction s’est engagée à « l’orphanize » ces récepteurs. Les systèmes in vitro conventionnelles permet d’identifier la substance odorante- ou interactions ont utilisé des milieux cellulaires en incubation avec odorant, qui se distingue par la détection naturelle des odeurs par dissolution de substances odorantes de vapeur dans la muqueuse nasale avant d’interagir avec les ORs. Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel de l’activation d’OR par l’intermédiaire de substances odorantes vapor phase. Notre méthode repose sur la mesure cAMP libération par luminescence à l’aide du test Glosensor. Il comble les lacunes entre les approches in vivo et in vitro et fournit une base pour un capteur chimique volatile biomimétique.

Introduction

Le sens de l’odorat permet d’interagir avec leur environnement chimique volatile d’émotions et de comportements en voiture, les animaux terrestres. Fondamentalement, le processus de détection d’odeur commence avec la première interaction des molécules odorantes avec le système olfactif, au niveau de l’odorisant récepteurs (ORs)1. Chez les mammifères, les ORs sont individuellement exprimés dans les neurones sensoriels olfactifs (OSNs) situés dans l’ épithélium olfactif2. Ils appartiennent à la famille G-protéine a couplé des récepteurs (GPCR) et plus précisément à la sous-famille de type rhodopsine (également appelé classe A). ORs de couple avec le stimulateur G protéine Golf dont l’activation mène à la production d’AMPc suivie de l’ouverture des canaux nucléotide cyclique contrôlé et la génération de potentiels d’action. Il est admis qu’un percept odeur s’appuie sur un modèle spécifique d’activés ORs3,4 et reconnaissance de l’odeur suit donc un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer un combinaison d’ORs. Et par le biais de ce codage combinatoire, on émet l’hypothèse que les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Une des clés pour comprendre la façon dont sont perçus les odeurs est de comprendre comment et qui sor est activés par une odeur donnée.

Pour tenter d’élucider odorant- ou des interactions, des essais fonctionnels in vitro ont joué un rôle essentiel. L’identification des ligands odorant agoniste pour orphelin ORs (dé-orphanization OR) a été un champ très actif pendant les vingt dernières années, grâce à l’utilisation de divers in vitro, ex vivo et des épreuves fonctionnelles in vivo5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

Systèmes de test in vitro sont plus adaptés pour la caractérisation fonctionnelle détaillée de RUP, y compris l’identification des domaines fonctionnels et résidus importants de SRO, ainsi que les applications potentielles de génie. Cependant, outre développement des systèmes in vitro précieux pour ORs a été un défi, en partie en raison de la difficulté avec OSNs culture et expression fonctionnelle d’ORs en cellules hétérologues. Le premier défi a été d’établir des protocoles permettant l’expression en surface cellulaire de SRO fonctionnelle dans le mappage de substance odorante-interactions OR. Un certain nombre de groupes indépendants ont utilisé diverses approches5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Une des premières réalisations a été faite par Krautwurst et coll. dans le tag N-terminal du sor avec une séquence raccourcie de la rhodopsine (Rho-tag) et observé une expression de surface améliorée de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)13. Modifications apportées à l’étiquette associée à la séquence de l’OR est toujours un chemin exploré pour améliorer OR expression et la fonctionnalité de19,21. Saito et al.. alors identifié la protéine du récepteur-transport 1 (RTP1) et RTP2 qui facilitent le trafic d’OR. 22 une version courte de RTP1, appelé RTP1S, a également démontrée pour être encore plus efficace que l’original de protéine23. Le développement d’une lignée cellulaire (Hana3A) qui exprime stablement Golf, REEP1, RTP1 et RTP2 24, associée à l’utilisation de reporters de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) a permis l’identification de la substance odorante-interactions OR. Le mécanisme par lequel la famille RTP de protéines favorise l’expression à la surface cellulaire de SRO reste à déterminer.

Une mise en garde de ces méthodes est qu’ils s’appuient sur la stimulation de la substance odorante en phase liquide, ce qui signifie que les composés malodorants sont préalablement dissous dans un milieu de stimulation et stimulent les cellules en remplaçant le milieu. C’est très distincte de l’état physiologique, où les molécules odorantes atteignent l’épithélium olfactif en phase gazeuse et activer l’ORs par dissolution dans la muqueuse nasale. Pour ressembler plus étroitement à exposition relance physiologiquement pertinents, Sanz et coll.20 a proposé une analyse basée sur la stimulation de la vapeur en appliquant une goutte de solution d’odorants à accrocher sous la face intérieure d’un film plastique sur le dessus du puits de la cellule. Ils ont enregistré les réponses de calcium en contrôlant l’intensité de la fluorescence. Cette méthode a été le premier à utiliser la stimulation odorante phase aérienne, mais elle ne permettait pas une grande projection d’activation de l’OR.

Ici, nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel d’activation in vitro d’OR via la stimulation de vapor phase odorant par le dosage de la Glosensor (Figure 1). Ce test a été utilisé précédemment dans le contexte du liquide odorant stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la chambre suivie du luminomètre est tout d’abord équilibrée avec vaporisé odorante avant plaque lecture (Figure 1A). Molécules odorantes sont solvatés dans la mémoire tampon, baignade Hana3A cellules exprimant l’OR d’intérêt, les RTP1S et les Glosensor de protéines (Figure 1B). Si l’odeur est un agoniste de l’OR, l’OR va passer à une conformation activée lier le Golf, activation de l’adénylate cyclase (AC) et finir par provoquer des taux d’AMPc à augmenter. Ce cAMP montante va se lier à et activer la protéine Glosensor pour générer la luminescence catalysant la luciférine. Cette luminescence est ensuite enregistrée par le luminomètre et permet la surveillance d’activation OR. Cette méthode est d’un grand intérêt dans le cadre de deorphanization d’OR car elle apporte des systèmes in vitro plus près à la perception naturelle des odeurs.

Protocol

1. Culture de cellules de Hana3A Préparer la M10 (milieu essentiel Minimum (MEM) plus 10 % v/v foetale de sérum bovin (FBS)) et M10PSF (M10 plus 100 µg/mL de pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL, amphotéricine B). La culture des cellules dans 10 mL de M10PSF dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2). Diviser les cellules tous les 2 jours à un taux de 20 % : lorsque 100 % confluence des cellules (enviro…

Representative Results

Nous avons projeté la réponse des trois ORs de souris, Olfr746, Olfr124 et Olfr1093 en utilisant une stimulation vapor Cinnamaldéhyde (Figure 3). En même temps, nous avons utilisé une lutte antivectorielle vide (Rho-pCI) pour assurer que les activités induite par l’odeur des RUP testés étaient spécifiques (Figure 3A). L’activation en temps réel des RUP sur relance de vapeur odorante a été surveillé mesure plus de 20 cycles. Les …

Discussion

La perception des odeurs dépend fondamentalement de l’activation de l’ORs. En conséquence, il faut comprendre leur fonctionnalité pour casser les mécanismes complexes qui le cerveau permet de percevoir son environnement chimique volatile. Cependant, la compréhension de ce processus a été entravée par les difficultés à établir une méthode robuste pour le répertoire de l’OR pour la fonctionnalité contre Odorisants in vitro. d’écran Cellule de surface et hétérologue expression de sor a ét?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC014423 et DC016224) et le Defense Advanced Research Office RealNose le projet. FJ est resté à l’Université Duke avec l’appui financier du programme JSPS pour faire progresser des réseaux stratégiques International accélérer la Circulation des chercheurs talentueux (R2801). Nous remercions Sahar Kaleem pour l’édition du manuscrit.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
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References

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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
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