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Neuroscience

In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Published: April 23, 2019
doi:
10.3791/59446
, , , ,
1Department of Molecular Genetics and Microbiology,Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science,Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology,Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering,Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research,Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences,Duke University

Summary

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

Abstract

Olfaktorischen Wahrnehmung beginnt mit dem Zusammenspiel von Riechstoffen mit Duftstoff-Rezeptoren (oder) durch olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) ausgedrückt. Geruch-Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff kann eine Kombination von Regionen in äußerster Randlage zu aktivieren. Organismen können durch solche kombinatorische Codierung erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. So kann ein Geruch in einer bestimmten Konzentration beschrieben werden durch ein Aktivierungsmuster von Regionen in äußerster Randlage, die ist spezifisch für jeden Geruch. In diesem Sinne knacken die Mechanismen, die das Gehirn benutzt, um Geruch erfordert Verständnis Geruchsstoff wahrnehmen-OR-Interaktionen. Deshalb die Geruchssinn Gemeinschaft verpflichtet “diese Rezeptoren de-orphanize” ist. Konventionellen in-vitro-Systeme zur Identifizierung von Duftstoff- oder Wechselwirkungen verwendet haben Inkubation Zelle Medien mit Duftstoff, die unterscheidet sich von der natürlichen Erkennung von Gerüchen über Dampf Geruchsstoffe Auflösung in Nasenschleimhaut vor Interaktion mit ORs. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der OR-Aktivierung per Dampfphase Geruchsstoffe. Unsere Methode basiert auf Messung cAMP Freigabe durch Lumineszenz unter Verwendung der Glosensor-Assay. Es überbrückt Lücken zwischen in vivo und in-vitro-Ansätzen und bildet die Grundlage für eine biomimetische flüchtiger chemischer Sensor.

Introduction

Der Geruchssinn ermöglicht terrestrischen Tieren interagieren mit ihren flüchtigen chemischen Umgebung Laufwerk Verhalten und Emotionen. Grundsätzlich beginnt die Geruch-Erkennung mit dem allerersten Zusammenspiel von Geruchsstoff Moleküle mit dem olfaktorischen System auf der Ebene der Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)1. Bei Säugetieren sind individuell olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel2Regionen in äußerster Randlage zum Ausdruck gebracht. Sie gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) Familie und genauer auf die Rhodopsin-ähnliche Unterfamilie (auch als Klasse A). Regionen in äußerster Randlage paar mit der stimulierende G Protein GOlf deren Aktivierung zu Lager Produktion, gefolgt von der Eröffnung der zyklische Nukleotid geschlossene Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Es wird angenommen, dass ein Geruch der Wahrnehmung stützt sich auf ein bestimmtes Muster von aktivierten ORs3,4 und deshalb Geruch Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff aktivieren kann ein Kombination von Regionen in äußerster Randlage. Und durch solche kombinatorische Codierung wird postuliert, daß Organismen erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. Ist einer der Schlüssel zum Verständnis, wie Gerüche wahrgenommen werden, zu verstehen wie und die Regionen in äußerster Randlage sind durch einen bestimmten Geruch aktiviert.

In einem Versuch, Geruchsstoff aufzuklären- oder Wechselwirkungen, in-vitro-funktionelle Untersuchungen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Die Identifizierung der Agonist duftende Liganden für Waise ORs (OR de Orphanization) ist seit den letzten zwanzig Jahren durch den Einsatz von verschiedenen in-vitro-, ex-Vivo- und in-vivo funktionelle Assays5,6,7 ein sehr aktives Feld ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In-vitro-Test-Systeme eignen sich am besten für die detaillierte funktionelle Charakterisierung der Regionen in äußerster Randlage, einschließlich Ermittlung der Funktionsbereiche und kritische Rückstände von Regionen in äußerster Randlage sowie mögliche technische Anwendungen. Jedoch hat weitere wertvolle in-vitro-Systeme für Regionen in äußerster Randlage eine Herausforderung, im Teil wegen Schwierigkeiten mit der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten und funktionelle Expression von ORs in heterologen Zellen entwickelt. Die erste Herausforderung gewesen, Protokolle zu etablieren, die für die Zelle Oberflächenexpression von funktionalen ORs in der Zuordnung der Geruchsstoff erlaubt-OR-Interaktionen. Eine Reihe von unabhängigen Gruppen haben verschiedene Ansätze5,6,7,8,9,10,11,12genutzt, 14,18,19,20. Eine der frühesten Errungenschaften wurde von Krautwurst Et Al. in der N-Terminus von Regionen in äußerster Randlage mit einem verkürzten Abfolge von Rhodopsin (Rho-Tag) markiert und eine verbesserte Oberflächenexpression in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen13beobachtet. Variationen gemacht, um den Tag angebracht, die OR-Sequenz ist immer noch ein Weg zur Verbesserung der OR Ausdruck und Funktionalität19,21erkundet. Saito Et Al. dann Rezeptor-der Transport von Protein 1 (RTP1) identifiziert und RTP2 die OR Handel erleichtern. 22 eine kürzere Version des RTP1, genannt RTP1S, hat auch gezeigt, sogar wirksamer als die ursprüngliche Protein23sein. Die Entwicklung einer Zelllinie (Hana3A), stabil GOlfausdrückt, REEP1, RTP1 und RTP2 24, gepaart mit dem Einsatz der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP) Reporter ermöglichte Identifizierung der Duftstoff-OR-Interaktionen. Der Mechanismus, durch die die RTP-Familie von Proteinen fördert die Zelle Oberflächenexpression von Regionen in äußerster Randlage bleibt bestimmt werden.

Ein Nachteil dieser etablierten Methoden ist, dass sie verlassen sich auf Geruchsstoff Stimulation in der flüssigen Phase, d.h. Geruchsstoffe werden vorab in einer Stimulation Medium aufgelöst und stimulieren Zellen durch das Medium zu ersetzen. Dies unterscheidet sich sehr von den physiologischen Bedingungen wo Geruchsstoff Moleküle erreichen das Riechepithel in der Dampfphase und ORs durch Auflösung in der Nasenschleimhaut zu aktivieren. Um mehr physiologisch relevanten Reiz Belichtung ähneln, schlug Sanz Et Al.20 einen Assay basierend auf Dampf Stimulation durch die Anwendung eines Tropfen Duftstoff Lösung hängen unter der Innenfläche aus einer Kunststofffolie auf Zelle Brunnen gelegt. Sie nahmen die Kalzium-Reaktionen durch die Überwachung der Fluoreszenzintensität. Diese Methode war die erste Luft-Phase Geruchsstoff Stimulation verwenden, aber es war es nicht möglich eine große Vorführung der OR-Aktivierung.

Hier entwickelten wir eine neue Methode, die es ermöglicht Echtzeit-Überwachung von in-vitro-OR-Aktivierung über Dampf Phase Geruchsstoff Stimulation durch die Glosensor-Assay (Abbildung 1). Dieser Test hat früher im Zusammenhang mit der flüssigen Duftstoff Stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. Überwachung Handelskammer die Luminometer ist zunächst equilibriert mit verdampftem Geruchsstoff vor der Platte lesen (Abb. 1A). Duftstoff-Moleküle sind dann solvatisierte in den Puffer, Baden Hana3A Zellen mit dem Ausdruck oder der Zinsen, RTP1S und die Glosensor Proteine (Abbildung 1B). Wenn der Geruchsstoff ein Agonist des OPS ist, wird OP wechseln Sie zu einer aktivierten Konformation GOlf, Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) zu binden und letztlich dazu führen, dass cAMP Stufen zu steigen. Diese steigende Campingplätze zu binden und aktivieren das Glosensor Protein um Lumineszenz katalysieren Luciferin zu generieren. Diese Lumineszenz wird dann durch die Luminometer aufgezeichnet und OR Aktivierung Überwachung ermöglicht. Diese Methode ist von großem Interesse im Rahmen der OR Deorphanization, da es die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen in-vitro-Systeme näher bringt.

Protocol

(1) Hana3A Zellen Kultur Bereiten Sie M10 (Minimum wesentliches Medium (MEM) zuzüglich 10 % V/V fetalen bovine Serum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B). Kulturzellen Sie in 10 mL M10PSF in der Kulturschale 100 mm Zelle in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) festgelegt. Alle 2 Tage bei einem Verhältnis von 20 % der Zellen zu teilen: Wenn 100 % Zusammenfluss von Zellen (ca. 1,1 x 107 Zellen) …

Representative Results

Wir sehen die Reaktion der drei Maus ORs, Olfr746, Olfr124 und Olfr1093 mit Zimtaldehyd Dampf Stimulation (Abbildung 3). Gleichzeitig verwendet wir eine leere Vektorregelung (Rho-pCI) um sicherzustellen, dass die Duftstoff-induzierten Aktivitäten der getesteten Regionen in äußerster Randlage bestimmte waren(Abbildung 3). Die Echtzeit-Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage auf Dampf Geruchsstoff Reiz war überwachten über 20 Messzyk…

Discussion

Die Wahrnehmung der Geruch ist wesentlich abhängig von der Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage. Infolgedessen ist Verständnis ihrer Funktionalität erforderlich, um die komplexen Mechanismen, mit denen das Gehirn seine flüchtige chemische Umgebung wahrnehmen zu knacken. Jedoch wurde das Verständnis dieses Prozesses durch die Schwierigkeiten bei der Einrichtung einer robusten Methode der OR-Repertoire für Funktionalität gegen Riechstoffe in-vitro-. auf dem Bildschirm behindert Zelle Oberfläche…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH (DC014423 und DC016224) und der Defense Advanced Research Agentur RealNose Projekt unterstützt. YF blieb an der Duke University mit finanzieller Unterstützung von JSPS Programm zur Förderung der strategischen internationale Netzwerke, die Zirkulation der talentierte Forscher (R2801) zu beschleunigen. Sahar Kaleem danken wir für die Bearbeitung des Manuskripts.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab – 100 ng/µL plasmid – store at 4°C
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References

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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).
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